摘要

背景

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種核酸擴(kuò)增方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)以高特異性合成大量DNA。由于其在恒定溫度下進(jìn)行，因此非常適合在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之外進(jìn)行快速診斷。這些特點(diǎn)使得LAMP適用于即時(shí)檢測(cè)（POC）應(yīng)用。然而，目前的POC檢測(cè)方法仍需要專(zhuān)用設(shè)備，并且反應(yīng)體積相對(duì)較大，從而增加了每次反應(yīng)的成本和適用性限制。

結(jié)果

本研究報(bào)道了一種基于微流控紙的分析裝置（μPAD），該裝置僅需不到7 μL的LAMP反應(yīng)樣本，即可產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色信號(hào)以區(qū)分陽(yáng)性樣本，從而實(shí)現(xiàn)肉眼檢測(cè)，減少了用戶(hù)的主觀(guān)性并降低了樣本分析的成本。其工作原理基于在μPAD中發(fā)生的鉬藍(lán)顯色和不可逆反應(yīng)，該反應(yīng)特別針對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)生的高靈敏度副產(chǎn)物焦磷酸鹽進(jìn)行優(yōu)化。作為概念驗(yàn)證，該裝置使用從亞洲 Liberibacter 細(xì)菌（導(dǎo)致黃龍病（HLB）的病原體）擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，μPAD的靈敏度可與瓊脂糖凝膠電泳方法相媲美，能夠檢測(cè)低至75 pg μL^-1的DNA模板，并且與HLB感染柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果具有相似的一致性。

意義

這項(xiàng)工作展示了一種先進(jìn)的分子診斷平臺(tái)，提供了新型、低成本且可現(xiàn)場(chǎng)部署的μPAD，這些μPAD有可能作為微流控設(shè)備中的檢測(cè)模塊，結(jié)合了LAMP的穩(wěn)健性和紙基顯色檢測(cè)的簡(jiǎn)便性。

引言

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）已成為最穩(wěn)健且研究最廣泛的現(xiàn)場(chǎng)診斷用核酸擴(kuò)增技術(shù)之一，例如用于傳染病檢測(cè)。該技術(shù)由Notomi于2000年首次描述，并由Nagamine進(jìn)一步優(yōu)化。由于LAMP能在短時(shí)間內(nèi)（<60分鐘）產(chǎn)生大量擴(kuò)增子（約10⁹），因此能夠快速檢測(cè)目標(biāo)寡核苷酸序列，具有極高的靈敏度。反應(yīng)在恒定溫度（60–65°C）下進(jìn)行，無(wú)需復(fù)雜的昂貴設(shè)備來(lái)產(chǎn)生熱循環(huán)。此外，簡(jiǎn)單的提取方法（如煮沸和切碎）也能有效從各種樣本類(lèi)型中釋放DNA，進(jìn)一步凸顯了LAMP在現(xiàn)場(chǎng)疾病診斷中的適用性。LAMP設(shè)備的進(jìn)步以及低成本或現(xiàn)場(chǎng)創(chuàng)新的分析方法的應(yīng)用，推動(dòng)了臨床診斷[4]、[5]、[6]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[7]、[8]、[9]、食品質(zhì)量控制[10]、[11]和法醫(yī)研究[13]、[14]的發(fā)展。這些進(jìn)步使得無(wú)需將樣本運(yùn)送至中心實(shí)驗(yàn)室即可快速進(jìn)行檢測(cè)，顯著縮短了周轉(zhuǎn)時(shí)間，降低了成本，并促進(jìn)了現(xiàn)場(chǎng)診斷，尤其是在偏遠(yuǎn)地區(qū)或大規(guī)模健康緊急情況下。此外，核酸擴(kuò)增測(cè)試對(duì)于生物防御至關(guān)重要，特別是在檢測(cè)和識(shí)別病原體方面，對(duì)于生物監(jiān)測(cè)至關(guān)重要，能夠快速準(zhǔn)確地識(shí)別生物威脅，無(wú)論是自然發(fā)生的、故意的還是意外的[15]、[16]。 世界衛(wèi)生組織（WHO）提出了即時(shí)檢測(cè)（POC）的ASSURED標(biāo)準(zhǔn)，即設(shè)備應(yīng)具備經(jīng)濟(jì)性、靈敏度、特異性、用戶(hù)友好性、快速性、穩(wěn)健性，并能直接提供給最終用戶(hù)。基于紙的微流控分析裝置（μPAD）被認(rèn)為是將傳感器集成到POC應(yīng)用中最合適的工具之一。紙基底通過(guò)毛細(xì)作用傳輸溶液，并具有多種額外優(yōu)勢(shì)，如易于使用、適應(yīng)多種檢測(cè)策略、低成本和環(huán)保[17]。用于檢測(cè)目的的紙改性方法顯示出巨大潛力，同時(shí)不會(huì)影響POC設(shè)備固有的簡(jiǎn)單性、便攜性和用戶(hù)友好性。例如，用凝膠[18]、[19]、金屬有機(jī)框架[20]或分子印跡聚合物[21]改性的μPAD表現(xiàn)出改進(jìn)的分析性能。 在POC應(yīng)用中，顯色檢測(cè)更為優(yōu)選，因?yàn)轭伾�變化可以用肉眼或智能手機(jī)輕松觀(guān)察[22]。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物通常通過(guò)熒光DNA插入分子或顯色染料進(jìn)行檢測(cè)[23]。熒光探針在與擴(kuò)增過(guò)程中生成的雙鏈DNA結(jié)合時(shí)增強(qiáng)發(fā)光[24]，而顯色指示劑則對(duì)游離鎂的變化作出反應(yīng)。隨著焦磷酸鹽（PPi）在反應(yīng)中的積累，Mg²⁺逐漸被捕獲，導(dǎo)致染料（如羥基萘酚藍(lán)（HNB）和鈣黃）發(fā)生可見(jiàn)的顏色變化[25]、[26]、[27]。此外，pH敏感指示劑也被用于LAMP的顯色讀數(shù)，因?yàn)閿U(kuò)增過(guò)程會(huì)釋放質(zhì)子，引起這些染料的特征性顏色變化[4]。 直接通過(guò)顯色方法檢測(cè)PPi的策略直到最近才被探索，因?yàn)橹�前的研究主要采用電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)[28]或無(wú)機(jī)磷酸鹽（Pi）的顯色檢測(cè)，后者需要額外的焦磷酸酶水解步驟[29]。在直接檢測(cè)PPi方面，Hokazono等人的工作（2024年）[30]尤為突出，他們提出了一種基于與Fe形成復(fù)合物的顯色反應(yīng)，能夠高靈敏度地檢測(cè)LAMP產(chǎn)生的PPi。Garg及其合作者的工作也值得注意，他們通過(guò)使用碳點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了PPi離子的檢測(cè)[31]。 在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種用于直接檢測(cè)PPi的μPAD，PPi是聚合反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的定量副產(chǎn)物。擴(kuò)增過(guò)程中生成的PPi與鉬酸鹽反應(yīng)形成高度穩(wěn)定的有色復(fù)合物。與pH或Mg²⁺依賴(lài)的指示劑不同，所得信號(hào)基本上是不可逆的，并且具有更高的視覺(jué)對(duì)比度，即使在非常低成本的診斷格式下也能輕松區(qū)分藍(lán)色陽(yáng)性結(jié)果和無(wú)色的陰性結(jié)果，無(wú)需儀器即可用肉眼觀(guān)察。這一特性對(duì)于需要簡(jiǎn)單流程和低成本以實(shí)現(xiàn)技術(shù)普及和應(yīng)用的POC設(shè)備特別有用。 概念驗(yàn)證是針對(duì)導(dǎo)致全球柑橘植物黃龍病（HLB）的病原體亞洲 Liberibacter 細(xì)菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，簡(jiǎn)稱(chēng)CLas）進(jìn)行的。一旦植物感染HLB，就無(wú)法恢復(fù)其健康，通常只能通過(guò)砍伐和焚燒來(lái)防止疾病傳播[32]。該疾病通過(guò)感染性繁殖材料（枝條或植物部分）或其昆蟲(chóng)媒介Diaphorina citri傳播，這種昆蟲(chóng)在美洲和亞洲廣泛存在。疾病預(yù)防計(jì)劃基于早期檢測(cè)和根除感染材料。因此，擁有能夠快速、靈敏且易于操作的現(xiàn)場(chǎng)診斷方法將非常有用。除了擴(kuò)增病原體遺傳物質(zhì)的測(cè)試外，還在開(kāi)發(fā)其他HLB檢測(cè)技術(shù)，包括檢測(cè)患病植物產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物變化的氣體傳感器[33]，以及通過(guò)分析患病葉片熒光模式變化（由于色素積累、離子缺乏和葉綠素降解等因素）的熒光成像分析[34]。LAMP-μPAD是一種替代方案，它通過(guò)直接識(shí)別CLas的遺傳物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)疾病檢測(cè)，完全符合POC設(shè)備的ASSURED標(biāo)準(zhǔn)，從而能夠迅速根除受感染的樹(shù)木，阻止疾病傳播。

試劑和溶液

聚維吡咯烷酮（PVP，分子量360,000）、聚乙烯醇（PVA，分子量89,000-98,000，水解度≥99%）、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、2-巰基乙醇、MgSO₄、KCl、Tris-HCl、Na₂HPO₄、Na₄P₂O₇·10H₂O、(NH₄)₂SO₄、Na₄P₂O₇（四堿式焦磷酸鈉）、Tween 20、甜菜堿一水合物、脫氧核苷三磷酸（dNTP）和氧化石墨烯（GO）均購(gòu)自Sigma-Aldrich（美國(guó)密蘇里州圣路易斯）。Bst DNA聚合酶大片段購(gòu)自英國(guó)Ipswich的新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室（New England Biolabs）。所有用于檢測(cè)CLas的寡核苷酸均按需訂購(gòu)。

反應(yīng)和設(shè)備優(yōu)化

鉬酸銨常用于酸性溶液中檢測(cè)無(wú)機(jī)磷（Pi）[38]。反應(yīng)分為兩個(gè)階段：首先在磷酸鹽和鉬酸鹽之間形成磷酸鉬酸鹽復(fù)合物，隨后該復(fù)合物被還原為鉬藍(lán)，可通過(guò)顯色或電化學(xué)方法進(jìn)行定量[39]、[40]、[41]。 μPAD的幾何設(shè)計(jì)將酸性鉬酸鹽與還原劑（2-巰基乙醇）空間分離。

結(jié)論

在本研究中，我們證明了LAMP與μPAD的結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)HLB檢測(cè)的快速簡(jiǎn)便讀數(shù)。μPAD的可定制性使其易于適應(yīng)不同的設(shè)備和環(huán)境，促進(jìn)了反應(yīng)的小型化，降低了成本，并確保了資源有限環(huán)境下的兼容性。此處開(kāi)發(fā)的μPAD的側(cè)向流動(dòng)特性也便于與其他微流控設(shè)備結(jié)合使用。

CRediT作者貢獻(xiàn)聲明

Adrian Vojnov： 監(jiān)督、方法學(xué)。 Fabiana Stolowicz： 撰寫(xiě)——審稿與編輯、初稿撰寫(xiě)、方法學(xué)、研究。 Lucas R. Sousa： 撰寫(xiě)——初稿撰寫(xiě)、方法學(xué)、研究、數(shù)據(jù)管理。 Sandra G. Vlachovsky： 撰寫(xiě)——初稿撰寫(xiě)、方法學(xué)、研究、數(shù)據(jù)分析。 Federico Figueredo： 撰寫(xiě)——審稿與編輯、監(jiān)督、資源獲取、概念構(gòu)思。 Eduardo Cortón： 撰寫(xiě)——審稿與編輯、可視化。

利益沖突聲明

作者聲明他們沒(méi)有已知的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系可能影響本文所述的工作。

數(shù)據(jù)可用性

數(shù)據(jù)可應(yīng)要求提供。

致謝

本工作得到了布宜諾斯艾利斯大學(xué)（UBA）和國(guó)家科學(xué)技術(shù)研究委員會(huì)（CONICET）的支持。作者衷心感謝國(guó)家科學(xué)技術(shù)促進(jìn)局（ANPCyT）（項(xiàng)目編號(hào)BID-PICT 2020-04023）和CONICET（項(xiàng)目編號(hào)PIP 2023-0047）的財(cái)政支持。