《Biochemical and Biophysical Research Communications》：SNCA (α-synuclein) H50Q mutation reveals distinct neurodegenerative patterns and adaptive responses in Parkinson's disease
Drosophila model
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帕金森病（PD）研究利用果蠅模型對(duì)比SNCA野生型和H50Q突變體的神經(jīng)毒性，發(fā)現(xiàn)突變體后期出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，但通過(guò)增強(qiáng)抗氧化機(jī)制（如 catalase活性降低提示氧化應(yīng)激）提升生存率，解釋了H50Q突變延遲發(fā)病的機(jī)制。
Jennifer Sally Samson|Kalyanaraman Rajagopal|Venkatachalam Deepa Parvathi
印度金奈斯里拉瑪昌德拉高等教育與研究學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系
摘要
帕金森病（PD）的特征是中腦多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化，這一過(guò)程與α-突觸核蛋白的聚集密切相關(guān)。矛盾的是，盡管SNCA H50Q突變與人類(lèi)家族性PD的延遲發(fā)病有關(guān)，但它在體外實(shí)驗(yàn)中會(huì)增強(qiáng)α-突觸核蛋白的聚集和細(xì)胞毒性，這突顯了闡明調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展的分子機(jī)制的必要性。在這項(xiàng)研究中，我們使用黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）作為體內(nèi)模型，來(lái)研究野生型（SNCA WT）和突變型（SNCA H50Q）在PD進(jìn)展過(guò)程中的神經(jīng)毒性。我們進(jìn)行了一系列行為學(xué)、生物化學(xué)和神經(jīng)解剖學(xué)分析。通過(guò)對(duì)不同年齡組（第10天、第20天和第30天）的攀爬和運(yùn)動(dòng)追蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SNCA WT果蠅表現(xiàn)出逐漸加重的運(yùn)動(dòng)功能障礙，同時(shí)中心回避指數(shù)增加，表明姿勢(shì)不穩(wěn)定和運(yùn)動(dòng)遲緩。SNCA H50Q果蠅在晚期表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)遲緩，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)距離縮短和運(yùn)動(dòng)輸出減少。對(duì)石蠟?zāi)X切片和眼睛的定性組織學(xué)評(píng)估以及掃描電子顯微鏡（SEM）分析顯示，SNCA H50Q果蠅存在形態(tài)學(xué)變化。生物化學(xué)分析表明SNCA WT果蠅有補(bǔ)償性的抗氧化反應(yīng)，而SNCA H50Q果蠅的過(guò)氧化氫酶活性降低，表明其氧化應(yīng)激增強(qiáng)。在結(jié)合遺傳學(xué)和羅通寧（rotenone）誘導(dǎo)的PD模型中，SNCA H50Q果蠅的存活率更高，表明其可能激活了適應(yīng)性應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制。總體而言，這些突變特異性表型強(qiáng)調(diào)了體內(nèi)模型在闡明調(diào)節(jié)疾病發(fā)作和進(jìn)展的適應(yīng)性機(jī)制方面的重要性。
引言
α-突觸核蛋白被認(rèn)為是帕金森病（PD）病理過(guò)程中路易小體（Lewy Body, LB）形成的關(guān)鍵成分，二十年前就有研究提出它與家族性PD有關(guān)[1,2]。編碼這種蛋白質(zhì)的基因SNCA位于4q22.1染色體上[3]。自1997年首次報(bào)道與SNCA A53T突變相關(guān)的家族性帕金森病以來(lái)[1]，研究人員還發(fā)現(xiàn)了其他幾種錯(cuò)義突變以及基因重復(fù)和三倍體，這些因素導(dǎo)致了罕見(jiàn)的家族性PD[4][5][6]。重要的是，SNCA基因的突變會(huì)導(dǎo)致常染色體顯性遺傳模式的家族性PD。
SNCA H50Q突變涉及α-突觸核蛋白中的組氨酸到谷氨酰胺的替換，它與人類(lèi)晚發(fā)性帕金森病（60-63歲發(fā)病）相關(guān)[7][8][9]，而早期發(fā)病的E46K和A53T突變則不同。矛盾的是，多項(xiàng)體外研究表明，H50Q突變會(huì)加速α-突觸核蛋白纖維的形成，并對(duì)其聚集傾向產(chǎn)生不同的影響[10][11][12][13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)了兩種獨(dú)特的遺傳性H50Q突變誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白多態(tài)性，即窄纖維和寬纖維形式，這些多態(tài)性表現(xiàn)出更快的纖維形成動(dòng)力學(xué)、更高的種子形成能力和增強(qiáng)的細(xì)胞毒性[14]。因此，鑒于體外實(shí)驗(yàn)中顯示的H50Q（α-突觸核蛋白）增強(qiáng)的聚集潛力和細(xì)胞毒性，人們可能會(huì)預(yù)期神經(jīng)退化的發(fā)生會(huì)更早。然而，攜帶SNCA H50Q突變的患者往往在較晚的年齡才出現(xiàn)癥狀[7][8][9]，盡管該突變具有更高的細(xì)胞毒性。這種體外觀察到的嚴(yán)重聚集傾向與臨床上的晚發(fā)性表現(xiàn)之間的明顯差異，突顯了H50Q突變的生物學(xué)獨(dú)特性，并暗示可能存在特定于突變的、年齡依賴(lài)性的補(bǔ)償或適應(yīng)機(jī)制，這些機(jī)制可能調(diào)節(jié)疾病的發(fā)作和進(jìn)展。闡明這些過(guò)程需要使用體內(nèi)模型來(lái)識(shí)別影響神經(jīng)退化時(shí)間動(dòng)態(tài)的突變特異性因素。
黑腹果蠅是一種無(wú)脊椎非哺乳動(dòng)物模型生物，已被廣泛用于研究包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種疾病的分子生物學(xué)[15]。由于其生命周期短、遺傳學(xué)特征明確、能夠行走和攀爬、壽命相對(duì)較短以及倫理問(wèn)題較少，這種生物在帕金森病研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值[16]。迄今為止，使用SNCA H50Q果蠅模型的體內(nèi)研究主要集中在表征突變特異性表型，特別是運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)退行性和代謝變化[17][18][19]。然而，整合年齡依賴(lài)的運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)、α-突觸核蛋白和環(huán)境毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性以及相關(guān)神經(jīng)解剖學(xué)變化的全面體內(nèi)評(píng)估在Ddc-GAL4驅(qū)動(dòng)的H50Q（α-突觸核蛋白）帕金森病果蠅模型中仍不夠充分。這種綜合分析對(duì)于闡明調(diào)節(jié)疾病發(fā)作和進(jìn)展的突變特異性機(jī)制至關(guān)重要。在本研究中，通過(guò)使用Ddc-GAL4驅(qū)動(dòng)子在果蠅模型中限制α-突觸核蛋白的表達(dá)，可以評(píng)估多巴胺能和5-羥色胺能神經(jīng)元群體的行為、神經(jīng)解剖學(xué)和生物化學(xué)表型，從而捕捉帕金森病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵特征。
我們研究了兩種轉(zhuǎn)基因果蠅模型：Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA WT+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA H50Q+/+，以探討這些SNCA變異體相關(guān)的不同疾病結(jié)果。這些果蠅與其相應(yīng)的對(duì)照組一起被系統(tǒng)地評(píng)估了一系列與PD相關(guān)的表型，包括攀爬（負(fù)地性）實(shí)驗(yàn)以及在定義的時(shí)間點(diǎn)對(duì)七個(gè)關(guān)鍵運(yùn)動(dòng)參數(shù)的詳細(xì)追蹤。使用蘇木精和伊紅（H&E）染色以及掃描電子顯微鏡（SEM）分析了果蠅大腦和復(fù)眼中的帕金森病相關(guān)神經(jīng)退行性變化。
在之前的研究中，氣味敏銳度缺陷先于運(yùn)動(dòng)障礙出現(xiàn)，并在氧化應(yīng)激下加劇[20]，從而表明氣味敏銳度是α-突觸核蛋白介導(dǎo)的神經(jīng)退行的早期功能標(biāo)志。基于此，我們檢查了野生型和突變型果蠅模型的氣味敏銳度，以確定這些SNCA變異體是否導(dǎo)致類(lèi)似的早期多巴胺能脆弱性。還分析了兩種SNCA果蠅模型中的乙醇誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜和恢復(fù)動(dòng)態(tài)，以評(píng)估這些指標(biāo)作為功能性神經(jīng)元損傷的潛力。
為了評(píng)估帕金森病進(jìn)展過(guò)程中的氧化應(yīng)激，我們量化了關(guān)鍵的抗氧化酶活性和氧化應(yīng)激標(biāo)志物。我們進(jìn)一步研究了這些遺傳模型對(duì)羅通寧（ROT）的敏感性，羅通寧是一種廣泛研究的環(huán)境性線粒體毒素，使用遺傳學(xué)和毒素誘導(dǎo)的帕金森病模型來(lái)評(píng)估果蠅在神經(jīng)毒性條件下的存活能力。進(jìn)行了壽命測(cè)定，以估計(jì)在Ddc-GAL4介導(dǎo)的基因表達(dá)下的SNCA果蠅模型的壽命。這種綜合方法提供了對(duì)SNCA相關(guān)病理性的多維度體內(nèi)分析。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于解釋H50Q相關(guān)帕金森病中α-突觸核蛋白聚集增強(qiáng)與癥狀延遲發(fā)作之間的矛盾，從而加深我們對(duì)突變特異性帕金森病發(fā)病機(jī)制的理解。
節(jié)選
果蠅品系和雜交
本研究中使用的所有果蠅品系均來(lái)自經(jīng)過(guò)認(rèn)證的果蠅品系中心。GAL4驅(qū)動(dòng)線（Ddc-GAL4/+）和UAS響應(yīng)線（UAS-SNCA WT+/+）來(lái)自印度邁索爾大學(xué)的國(guó)家果蠅品系中心，而GMR-GAL4/+驅(qū)動(dòng)線來(lái)自印度浦那的印度科學(xué)教育與研究學(xué)院（IISER）。突變果蠅模型（BL-80045 w[?]; P{w[+mC]=UAS-hSNCA.H50Q}2/CyO）由S. C. Lakhotia教授提供。
SNCA轉(zhuǎn)基因果蠅模型中攀爬能力的基因型和年齡依賴(lài)性調(diào)節(jié)
通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（第10天，p = 0.0001142；第20天，p = 0.00009536；第30天，p = 0.003264），發(fā)現(xiàn)UAS-SNCA WT+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA WT+/+果蠅在每個(gè)年齡段的攀爬能力存在顯著差異（圖4A–C）。同樣，通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（第10天，p = 0.000103；第20天，p = 0.0421；第30天，p = ）發(fā)現(xiàn)UAS-SNCA H50Q+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA H50Q+/+果蠅在每個(gè)年齡段的攀爬表現(xiàn)也存在顯著差異。
討論
SNCA基因（α-突觸核蛋白）因其在中散發(fā)性及家族性帕金森病發(fā)病機(jī)制中的主要作用而受到廣泛研究。由于該蛋白具有聚集形成有毒寡聚體的傾向，這會(huì)損害線粒體功能并促進(jìn)ROS積累，因此明確不同SNCA突變相關(guān)的神經(jīng)退化程度非常重要。在本研究中，我們研究了SNCA變異體（即野生型和H50Q）在轉(zhuǎn)基因果蠅中的效應(yīng)。
結(jié)論
目前的發(fā)現(xiàn)表明，攜帶H50Q突變的患者可能存在類(lèi)似的補(bǔ)償機(jī)制，這些機(jī)制可能緩沖α-突觸核蛋白引起的毒性，從而延緩臨床癥狀的出現(xiàn)，盡管該突變具有更高的細(xì)胞毒性。此外，我們的結(jié)果表明，果蠅帕金森病模型是進(jìn)行系統(tǒng)和比較性臨床前評(píng)估的寶貴體內(nèi)平臺(tái)，有助于在早期識(shí)別治療策略。
倫理批準(zhǔn)
已獲得機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，日期為2022年10月11日。
資助
本研究未獲得公共、商業(yè)或非營(yíng)利部門(mén)的任何特定資助。這項(xiàng)工作是Jennifer Sally Samson博士的博士研究項(xiàng)目的一部分，該博士研究由印度金奈SRIHER的創(chuàng)始人校長(zhǎng)Shri. NPV Ramasamy Udayar獎(jiǎng)學(xué)金資助。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Jennifer Sally Samson：概念構(gòu)思、形式分析、研究、方法論、撰寫(xiě)——初稿。Kalyanaraman Rajagopal：驗(yàn)證、撰寫(xiě)——審閱和編輯。Venkatachalam Deepa Parvathi：概念構(gòu)思、數(shù)據(jù)管理、研究、項(xiàng)目管理、監(jiān)督、驗(yàn)證、撰寫(xiě)——審閱和編輯。利益沖突聲明
作者聲明他們沒(méi)有已知的利益沖突或個(gè)人關(guān)系可能影響本文所述的工作。
致謝
我們衷心感謝S.C. Lakhotia教授提供UAS-SNCA H50Q+/+果蠅品系。我們感謝Sathyabama科學(xué)技術(shù)學(xué)院的Viswanathan Kanagasabai博士在FESEM分析方面的幫助，也感謝Sundaram S. Gnanasekaran先生在組織學(xué)檢查方面的支持。
