《Frontiers in Immunology》：Mitochondrial dysfunction and immune microenvironment in gestational diabetes mellitus: insights from bioinformatics analysis and experimental validation
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本研究通過整合GSE203346（批量RNA-seq）和GSE173193（單細胞RNA-seq）轉錄組數據與MitoCarta3.0線粒體基因集，結合LASSO、隨機森林（RF）和XGBoost三種機器學習算法，鑒定出DHRS2、STX17和TIMM44三個核心線粒體相關基因（Mito-RGs）。基于這三個基因構建的Mito-RGs評分（Mito-RGs score）聯合臨床變量建立的列線圖（nomogram）能有效預測妊娠期糖尿病（GDM）。單細胞RNA-seq分析揭示了GDM胎盤組織中上皮細胞、巨噬細胞和自然殺傷（NK）細胞比例增加，而組織干細胞比例顯著減少，且不同細胞類型中分別富集了糖酵解、缺氧及炎癥激活等相關通路，表明線粒體功能障礙促進了胎盤免疫微環境的促炎性重編程。最后，該研究在GDM患者胎盤組織和高脂飲食（HFD）誘導的GDM小鼠模型中對關鍵基因進行了免疫組化驗證，證實了DHRS2表達顯著升高，為理解GDM的病理機制和尋找干預靶點提供了新思路。
引言
妊娠期糖尿病是一種在妊娠期間發生或首次識別的以高血糖為特征的常見并發癥，全球發病率約14%。它不僅損害母體健康，增加剖宮產、2型糖尿病和心血管疾病風險，還會導致胎兒巨大兒、新生兒低血糖和長期代謝紊亂等不良結局。盡管GDM帶來了巨大的公共衛生負擔，但其進展的機制仍未完全闡明。線粒體是復雜的雙膜細胞器，除了通過氧化磷酸化產生三磷酸腺苷（ATP）外，還對鈣調節、活性氧（ROS）產生、免疫信號傳導和細胞凋亡至關重要。越來越多的證據表明，線粒體功能障礙通過破壞胎盤的代謝信號傳導和促進氧化應激，在GDM的病理變化中起著關鍵作用。同時，免疫失調也被證明是GDM發展的關鍵因素。胎盤組織中存在巨噬細胞、中性粒細胞和T細胞亞群等免疫細胞浸潤的改變，這些細胞與滋養層細胞密切相互作用，創造出一種促炎環境，加劇了胰島素抵抗。線粒體功能障礙與免疫失調似乎緊密交織，形成惡性循環。本研究旨在利用生物信息學與實驗驗證相結合的方法，探索線粒體相關基因在GDM中的作用及其與免疫微環境的相互作用，為GDM的早期診斷和有效治療策略提供新的見解。
材料與方法
基因表達數據集從GEO數據庫獲取，包括GDM和健康妊娠的批量RNA-seq數據集（GSE203346，含21例GDM和22例對照）以及胎盤組織樣本的單細胞RNA-seq數據（GSE173193，含2例GDM和2例對照）。從MitoCarta3.0數據庫中提取了1136個線粒體相關基因列表。使用R包“limma”鑒定GDM組與對照組之間差異表達的Mito-RGs，標準為|log2FoldChange (FC)| > 0.585且校正P值 < 0.05。通過GO、KEGG和GSEA對差異基因進行功能富集分析。采用三種機器學習算法——最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸、隨機森林（RF）和極端梯度提升（XGBoost）來識別核心Mito-RGs。基于核心基因，通過多變量邏輯回歸計算Mito-RGs評分，并聯合臨床變量構建預測GDM的列線圖。使用ImmuCellAI算法評估胎盤組織中不同免疫細胞類型的浸潤水平。對單細胞RNA-seq數據進行了質量控制、歸一化、主成分分析（PCA）降維和基于圖的聚類，并使用Uniform Manif Approximation and Projection（UMAP）進行可視化。通過SingleR進行細胞類型注釋。使用“AddModuleScore”函數在單細胞水平計算Mito-RGs評分，并通過基因集變異分析（GSVA）和單細胞GSEA分析不同細胞類型的生物學功能差異。利用“CellChat”包基于配體-受體相互作用推斷細胞間通訊網絡。從山東第一醫科大學附屬教學醫院收集了GDM孕婦和健康對照的胎盤組織樣本。通過高脂飲食（HFD）喂養誘導C57BL/6-J小鼠建立GDM模型，并通過口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）確認模型成功。對人和小鼠胎盤組織進行免疫組化染色，以評估脫氫酶/還原酶成員2（DHRS2）、突觸融合蛋白17（STX17）和線粒體內膜轉位酶44（TIMM44）的蛋白表達。
結果
差異表達的Mito-RGs及其功能富集分析
通過與MitoCarta3.0數據庫比對，在GSE203346數據集中共鑒定出29個在GDM樣本中顯著上調的差異表達Mito-RGs。火山圖和層次聚類熱圖可視化了這些基因的分布和表達模式。功能富集分析顯示，這些基因在氧化還原酶活性、脂肪酸結合和小分子代謝等生物過程中顯著富集。KEGG通路分析表明它們參與了檸檬酸循環（TCA循環）、脂肪酸代謝和谷胱甘肽代謝等代謝途徑。基因集富集分析（GSEA）進一步揭示，在GDM中，與線粒體膜組織、線粒體外膜通透性（涉及程序性細胞死亡）和線粒體呼吸鏈復合物組裝相關的通路受到顯著抑制。
通過機器學習算法鑒定GDM中的核心Mito-RGs
LASSO回歸通過10折交叉驗證選擇了22個基因，RF和XGBoost算法各自篩選出重要性排名前10的基因。整合三種算法的結果，維恩圖顯示DHRS2、STX17和TIMM44是三種算法共同鑒定的核心Mito-RGs。這三個核心基因在GDM胎盤組織中的mRNA表達水平均顯著高于對照組。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示，這三個基因各自對GDM有一定的診斷性能，曲線下面積（AUC）分別為0.738（DHRS2）、0.649（STX17）和0.688（TIMM44）。基于這三個基因計算的復合Mito-RGs評分在GDM組中也顯著升高，其AUC為0.725。相關性熱圖分析顯示，Mito-RGs評分與體質指數（BMI）呈正相關。
基于Mito-RGs評分的列線圖建立及GDM中免疫細胞浸潤評估
單變量和多變量邏輯回歸分析均表明，Mito-RGs評分是GDM風險的強獨立預測因子。通過整合孕周、母親年齡、BMI分類和Mito-RGs評分，構建了用于預測個體GDM風險的列線圖。該列線圖的ROC分析顯示其具有良好的診斷性能，AUC為0.761。校準曲線顯示預測風險概率與觀察到的風險概率高度一致。決策曲線分析（DCA）表明，在較寬的風險閾值范圍內，該列線圖能提供顯著的凈臨床收益。使用ImmuCellAI算法分析免疫細胞浸潤差異發現，與對照組相比，GDM胎盤樣本中樹突狀細胞（DCs）、巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞和CD8+T細胞的浸潤顯著增加，表明GDM患者存在胎盤免疫細胞組成的改變和免疫功能的異常激活。
在單細胞分辨率下驗證核心Mito-RGs
對單細胞RNA-seq數據進行分析，在質量控制后，共鑒定出15個不同的細胞簇。UMAP圖顯示GDM和對照組樣本的細胞群之間存在明顯分離，表明細胞組成存在顯著差異。通過標記基因和SingleR注釋，確定了主要細胞類型，包括上皮細胞、內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓細胞、NK細胞、B細胞、常見髓系祖細胞（CMPs）和組織干細胞。定量分析表明，與對照組相比，GDM組中上皮細胞、巨噬細胞、NK細胞和B細胞的比例有升高趨勢，而組織干細胞比例降低。特征圖顯示，DHRS2、STX17和TIMM44主要在上皮細胞、巨噬細胞、組織干細胞和NK細胞中表達。Mito-RGs評分圖譜顯示，該評分在上皮細胞、組織干細胞、NK細胞和巨噬細胞中富集程度較高。單細胞GSVA富集分析顯示，上皮細胞中脂質代謝、糖酵解、氧化磷酸化和增殖通路顯著激活。巨噬細胞則表現出凋亡、炎癥反應和代謝通路的激活。NK細胞中與增殖相關的生物過程顯著激活。單細胞GSEA進一步證實，糖酵解、氧化磷酸化、缺氧、凋亡和活性氧相關通路主要在上皮細胞中激活；而包括抗原加工和呈遞、IL6-JAK-STAT3信號通路、炎癥反應和TNF-α通過NF-κB的信號傳導在內的多種炎癥激活相關通路，則主要在巨噬細胞中富集。細胞間通訊網絡分析強調了上皮細胞、巨噬細胞和單核細胞之間在GDM中存在強烈的相互作用。研究還識別出了關鍵的配體-受體通路，包括B細胞與其他細胞類型之間的TGFB1-TGFBR1/TGFBR2信號傳導、上皮細胞與其他細胞之間的FN1-ITGA5/ITGB1信號傳導，以及巨噬細胞與其他細胞類型之間的LAMA5-CD44信號傳導。
在人類胎盤組織和GDM小鼠模型中驗證核心Mito-RGs
研究共納入了12名孕婦，分為GDM組和對照組。對收集的人類胎盤組織進行免疫組化分析發現，與對照組相比，GDM女性胎盤樣本中DHRS2和STX17的表達顯著上調，而TIMM44水平無顯著差異。通過高脂飲食成功建立了GDM小鼠模型。體重監測顯示，GDM小鼠體重持續高于對照組，至第6周時差異具有統計學意義。口服葡萄糖耐量試驗結果顯示，在葡萄糖給藥后30、60、90和120分鐘，GDM小鼠的血糖水平均顯著高于對照組，而空腹血糖水平無顯著差異。對小鼠胎盤組織的免疫組化分析進一步驗證了核心Mito-RGs的上調。在GDM胎盤中，DHRS2和TIMM44的表達水平顯著高于對照組，而STX17雖有上升趨勢但未達到統計學顯著性。
討論
本研究的結果與之前的報告一致，證實了線粒體功能障礙是GDM胎盤的一個標志。功能富集分析揭示了這些基因主要參與氧化磷酸化、脂肪酸代謝和TCA循環等關鍵能量代謝通路。GSEA顯示與線粒體結構和ATP生成相關的通路受到抑制，支持了GDM胎盤線粒體功能受損的觀點。鑒定出的三個核心Mito-RGs（DHRS2、STX17和TIMM44）在GDM中發揮著重要作用。STX17在自噬特別是線粒體自噬中起關鍵作用。TIMM44是線粒體內膜轉位酶復合物輸入馬達的關鍵部分，對線粒體蛋白質輸入和組裝至關重要。DHRS2對于維持氧化還原平衡和減輕氧化應激至關重要。在驗證研究中，DHRS2在生物信息學、人類和小鼠數據中均一致上調，表明它可能是GDM的關鍵調控因子。人類和小鼠組織之間STX17和TIMM44表達的差異可能源于物種特異性調控、樣本異質性或方法學限制。研究發現GDM胎盤組織中促炎免疫細胞顯著增加，這與之前的報告一致，表明免疫過度激活參與了GDM的病理生理過程。單細胞RNA-seq分析進一步揭示了GDM胎盤中上皮細胞、巨噬細胞和NK細胞比例升高，組織干細胞比例顯著降低的細胞組成變化。通路分析證實，在GDM胎盤的上皮細胞和組織干細胞中，與線粒體功能障礙相關的生物過程顯著激活；而在巨噬細胞中，關鍵炎癥通路被上調。這些結果表明，上皮細胞、組織干細胞和巨噬細胞中的線粒體功能障礙共同促成了GDM中促炎免疫微環境的形成。本研究的優勢在于應用了多種機器學習算法，從大量候選基因中穩健地識別出核心Mito-RGs，并通過實驗驗證增強了結果的可靠性。此外，基于核心基因開發Mito-RGs評分并將其整合到包含臨床變量的列線圖中，顯著提高了預測性能，為GDM的早期診斷和風險分層提供了有價值的工具。然而，本研究也存在一些局限性，包括樣本量較小，單細胞RNA-seq分析的樣本尤其有限；線粒體功能障礙與免疫微環境相互作用的確切分子機制尚未完全闡明；未在小鼠模型中通過流式細胞術等多重方法評估免疫細胞浸潤；以及Mito-RGs評分在無創診斷中的潛在應用尚未探索。未來的研究需要在更大的隊列中進行驗證，并通過體內外實驗闡明核心基因的具體功能機制。
結論
總而言之，本研究強調了線粒體功能障礙和免疫失調對GDM發病機制的重要貢獻。核心Mito-RGs（DHRS2、STX17和TIMM44）的鑒定以及基于Mito-RGs評分的風險預測工具的開發，凸顯了其潛在的診斷價值和臨床實用性。這些發現為未來GDM的臨床轉化和精準醫學方法提供了寶貴的見解和堅實的基礎。
