肥胖已成為全球性流行病，顯著增加多種慢性疾病風險。腸道菌群作為人體微生態的核心成員，在調節宿主能量代謝、免疫穩態以及通過腸-腦軸參與情緒和神經行為調控中發揮著關鍵作用。而作為人體第二大微生物庫的口腔，其菌群失調不僅與牙周病相關，也通過系統性炎癥、一過性菌血癥及沿口腔-腸道軸的轉移，參與肥胖、心血管疾病和阿爾茨海默病等的發展。高脂飲食可同時誘導口腔和腸道菌群的改變，但現有研究大多為橫斷面調查，缺乏在統一實驗框架下整合多年齡組、多維表型（包括口腔-腸道菌群、代謝、肝損傷、缺氧、神經行為）的縱向動物研究。本研究旨在建立跨越多個年齡組的高脂飲食誘導肥胖小鼠模型，運用16S rRNA測序技術，闡明肥胖與衰老的系統性后果，探索與年齡增長相關的菌群驅動的肥胖內型，并識別可作為未來機制/干預研究候選生物標志物的標記菌屬。

研究使用五周齡雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為標準飲食組（SCD）和高脂飲食組（HFD），分別維持至4月齡（青年組）、12月齡（中年組）和18月齡（老年組），隨后處死。研究設計示意圖展示了分組、時間線和各項檢測。評估指標包括體重、Lee指數、葡萄糖-脂質代謝、肝功能、血氧水平，以及情緒和認知行為測試。采集血液樣本通過ELISA法定量脂多糖（LPS）和β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ_1–42）水平。采集口腔和糞便樣本進行16S rRNA測序分析菌群多樣性和群落結構。通過線性判別分析效應量（LEfSe）識別差異菌屬，并將口腔和糞便樣本中均發生一致改變的菌屬操作性地定義為標記菌屬。采用靶向代謝組學分析短鏈脂肪酸（SCFAs）譜。相關性分析使用Spearman方法。

實驗期間，HFD組小鼠體重持續高于SCD組。從第12周開始，HFD小鼠體重顯著高于同齡對照。HFD小鼠的體長和Lee指數也顯著增加。不同年齡組小鼠的背部大體照片直觀顯示了體型差異。與青年組不同，中年和老年HFD小鼠的前肢抓力顯著降低。HFD小鼠在青年、中年、老年組的肝臟重量均顯著高于對照組。肝臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色顯示，與同齡對照相比，HFD小鼠肝臟出現肝索排列紊亂、肝細胞增大、細胞質大空泡將核擠向邊緣以及炎癥灶。老年HFD組還觀察到散在肝細胞壞死。脂肪組織HE染色顯示，HFD小鼠脂肪細胞更大，炎癥細胞更分散，細胞異質性更高。老年HFD組可見大小不一的脂肪細胞混合簇，間質組織逐漸增厚并形成冠狀結構。肝臟油紅O染色顯示，與同齡對照相比，HFD小鼠陽性染色面積顯著增加。

血氧測量顯示，在中、老年組，HFD小鼠的外周血氧飽和度（SpO₂）低于SCD對照。在老年組，HFD小鼠的動脈氧分壓（PaO₂）和動脈血氧飽和度（SaO₂）也顯著降低。在葡萄糖和脂質代謝方面，HFD小鼠在所有三個年齡組均表現出顯著升高的葡萄糖耐量曲線，峰值更高且恢復基線更慢，表明其葡萄糖耐受受損。注射胰島素后，所有年齡組HFD小鼠的血糖下降幅度均顯著小于SCD小鼠，表明高脂飲食誘導了胰島素敏感性降低。青年HFD組的空腹血糖顯著高于對照，但中、老年組組間差異不顯著。HFD小鼠的血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和總膽固醇（TC）在所有年齡組均顯著升高，而甘油三酯（TG）水平無顯著差異。HFD小鼠在所有年齡組的血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平均顯著升高。血清乳酸脫氫酶（LDH）在青年組無差異，但在中、老年HFD組顯著升高。神經炎癥和神經損傷標志物方面，HFD小鼠在所有年齡組的血清Aβ_1–42水平均顯著高于對照。皮質Aβ_1–42在老年HFD組升高，而海馬Aβ_1–42無顯著差異。S100β水平在所有年齡組均無顯著差異。血清LPS在老年HFD組增加，皮質LPS在中、老年HFD小鼠中升高。血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）無組間差異，但皮質TNF-α在老年HFD組升高。血清和皮質中的白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）水平無顯著差異。

在所有行為測試中，高脂飲食顯著影響了焦慮樣、社交和認知行為，而年齡及飲食與年齡的交互作用影響了自發交替、不動時間和空間記憶等特定指標。在高架十字迷宮（EPM）中，中、老年HFD小鼠進入開放臂的次數和時間均減少，反映出焦慮增加。在強迫游泳測試（FST）中，中年HFD小鼠的不動時間增加，表明抑郁樣行為增強。在Morris水迷宮（MWM）中，青年HFD小鼠在目標象限停留時間更短，穿越平臺次數更少，提示空間學習缺陷；而在老年小鼠中，這些差異不顯著，表明衰老可能掩蓋了HFD誘導的空間學習缺陷。在訓練期間，HFD小鼠也表現出更長的逃避潛伏期。一系列行為測試結果以柱狀圖和折線圖形式匯總。

與同齡SCD對照相比，HFD小鼠的口腔菌群Chao1指數在青年和老年組顯著降低，而Good's coverage指數在所有三個HFD年齡組均顯著增加。對于腸道菌群，HFD小鼠在所有年齡組的Chao1指數顯著降低，Good's coverage指數顯著升高。基于Jaccard距離的主坐標分析顯示，在所有年齡組，HFD與SCD小鼠的口腔和腸道菌群β多樣性存在顯著差異，而組內差異不顯著。非加權組平均法（UPGMA）層次聚類樹也顯示，HFD和SCD小鼠的口腔和腸道微生物群落各自有明顯的聚類趨勢。這些發現表明，高脂飲食誘導了微生物群落組成的顯著且廣泛的改變。菌群多樣性和聚類分析結果在圖表中展示。

基于PICRUSt2的京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能預測顯示，HFD組的菌群在能量和脂質代謝相關通路上顯著富集，包括丁酸鹽代謝、脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸代謝和酮體代謝。而SCD組則在營養代謝和群落穩態相關通路上富集度更高，如多糖降解、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化以及維生素代謝。同時，HFD組還富集了與DNA修復、細菌趨化性以及多種抗生素耐藥性和感染相關過程相關的通路，表明高脂飲食驅動菌群功能向增強環境壓力適應、運動性和致病潛力方向重塑。

使用LDA分數大于2且P值小于0.05的標準，LEfSe分析在屬水平上識別出HFD和SCD小鼠之間的差異微生物類群。在所有年齡組和口腔、糞便樣本中，Romboutsia_B在HFD小鼠中持續富集，而Ruminococcus_C、Duncaniella和Eubacterium在SCD小鼠中富集。一些與病原體和炎癥相關的菌屬（如Escherichia、Streptococcus、Bilophila、Bacteroides_H）在HFD小鼠中反復出現，而與健康和穩態相關的菌屬（如Bifidobacterium、Akkermansia、Muribaculum、Paramuribaculum）在SCD小鼠中富集。LEfSe分析結果以橫向條形圖展示，突出了與不同飲食和年齡組相關的菌屬。

糞便中直鏈和支鏈短鏈脂肪酸（SCFAs）的譜圖在高脂飲食條件下呈現相反的變化。在青年和中年組，HFD組的總直鏈SCFAs（scSCFAs）顯著低于SCD組，而老年組兩組間無顯著差異。相反，HFD組在所有三個年齡組的總支鏈SCFAs（bcSCFAs）均顯著增加。綜上，功能預測和SCFAs分析支持高脂飲食誘導了結腸微生物發酵的重編程，其特征是支鏈SCFAs產量增加和多糖降解能力降低。

Spearman相關性分析探討了差異豐度類群與各種生理和行為測試之間的關聯。Romboutsia_B和Escherichia與體長、體重、Lee指數、ALT、LDH、HDL-C、LDL-C、TC、Aβ_1–42、S100β、LPS、TNF-α、IL-6以及bcSCFAs呈正相關。這些菌屬還與三室社交測試（TCST）中的社交偏好指數、強迫游泳測試中的不動時間以及Morris水迷宮中的逃避潛伏期呈正相關。相反，它們與SpO₂、PaO₂、SaO₂、IL-10以及scSCFAs呈負相關，同時也與前肢抓力、曠場實驗中心區停留時間和距離、Y-迷宮自發交替率、高架十字迷宮開放臂進入次數和時間、社交新奇偏好指數以及Morris水迷宮的平臺穿越次數和探測試驗表現呈負相關。相反，Ruminococcus_C、Duncaniella、Eubacterium、Bifidobacterium、Akkermansia、Muribaculum和Prevotella則表現出相反的相關性模式。相關性分析結果以箱線圖和熱圖呈現。

本研究建立了覆蓋成年早期至老年期的長期高脂飲食誘導肥胖模型。我們發現，高脂飲食在所有年齡階段均誘導了典型的肥胖和代謝綜合征表型。隨著小鼠年齡增長和飼喂時間延長，高脂飲食小鼠逐漸發展為以SpO₂、PaO₂和SaO₂下降為特征的慢性缺氧狀態，并伴有血清和皮質Aβ_1–42和LPS水平升高，以及空間學習記憶受損和加劇的焦慮、抑郁樣行為。在微生物組層面，我們觀察到所有三個年齡組的HFD小鼠其口腔和腸道菌群的α多樣性均下降，且β多樣性聚類模式發生顯著變化，支持了肥胖及其相關代謝異常伴隨系統性黏膜微生態重塑的觀點。我們發現，在口腔和腸道微生物組中，與炎癥和高代謝負荷相關的菌屬，如Romboutsia和Escherichia，持續富集，而與代謝健康相關的菌屬，包括Ruminococcus、Bifidobacterium和Akkermansia則相對減少。這些發現將傳統的腸道菌群-肥胖-代謝疾病框架擴展到了更全面的、整合了口腔微生物組和神經認知功能的“口腔-腸道-肝臟-大腦”軸。

本研究在HFD與SCD組的比較中發現了口腔和腸道菌群失調。在差異菌屬中，Romboutsia在長期高脂飲食小鼠模型的口腔和腸道中以及不同年齡階段均表現出一致的富集。相關性分析表明，Romboutsia的豐度與全身性代謝改變、慢性炎癥和腦功能損害（包括行為和認知變化）密切相關。這些結果表明，Romboutsia可能是連接口腔-腸道微生物組與肥胖相關的全身性和神經功能障礙的核心微生物標志物。Romboutsia是消化鏈球菌科內的嚴格厭氧菌屬，具有廣泛的代謝能力。結合大型人類隊列和高脂飲食動物模型的證據，我們發現Romboutsia_B與肥胖、血脂異常和肝損傷相關，支持了其作為代謝功能障礙微生物標志物的地位。改善代謝健康的營養干預通常會減少Romboutsia并恢復產SCFAs的菌群，表明較高的Romboutsia豐度與菌群失調相關，并且在代謝改善的背景下可能是可調節的。本研究還觀察到較高的Romboutsia豐度與較低的氧飽和度相關。綜上所述，這些發現表明，長期高脂飲食，特別是與缺氧相結合時，可能有利于Romboutsia的擴增，這可能伴隨著更高的全身代謝負荷和炎癥，增加了肥胖相關神經損傷的易感性。

在本研究中，Romboutsia_B與增加的LPS、TNF-α和Aβ_1–42水平以及認知行為受損呈強相關，這與最近將Romboutsia與腸-腦軸失調聯系起來的人類和動物研究一致。結合本研究的KEGG功能預測和靶向代謝組學結果，我們提出了一個初步的機制假設：在長期高脂飲食條件下，以Romboutsia為代表的一組類群在口腔和腸道中同步增加，可能導致微生物代謝重塑。這種重塑可能與脂肪酸和酮體利用增強、氨基酸代謝和DNA損傷修復途徑活性增加有關，并可能在高脂環境中獲得生長優勢。同時，它與短鏈脂肪酸譜的改變（在某些年齡組bcSCFAs增加而scSCFAs減少）相關，可能與膽汁酸池的改變有關，并與更高的細菌成分負荷相關。這些變化共同加劇肝臟脂質積累和炎癥，并可能通過口腔-腸道-肝臟-大腦軸促進神經炎癥，從而將微生物失調與慢性高脂飲食暴露下的代謝和神經功能障礙聯系起來。

本研究發現，Escherichia表現出與Romboutsia_B相似的模式，在高脂飲食條件下于口腔和腸道中富集，并與肥胖、血脂異常、肝酶升高、炎癥和認知障礙廣泛正相關，而與血氧和抗炎因子呈負相關。我們認為，Escherichia通過LPS介導的炎癥，與Romboutsia一起，可能代表了一個與高脂飲食誘導的肥胖、肝損傷和中樞神經系統功能障礙相關的代謝負荷和炎癥放大微生物軸共現模塊。

與高脂飲食富集的類群相反，對照小鼠在口腔和腸道中均顯著富集了Ruminococcus_C、Bifidobacterium、Eubacterium、Akkermansia和Muribaculum。它們的豐度通常與體重、血脂、肝酶和炎癥標志物呈負相關，與更好的情緒和認知表現呈正相關。這些發現與現有文獻一致，共同表明了這組類群的代謝保護作用。

在高脂飲食條件下，與炎癥相關的類群如Romboutsia_B和Escherichia擴增，而通常與代謝健康相關的類群，包括Ruminococcus_C、Bifidobacterium、Eubacterium、Akkermansia和Muribaculum則相對減少。這種模式符合口腔和腸道菌群從產SCFAs、維持屏障的狀態向炎癥相關、脂質和膽汁酸負荷狀態轉變的框架。在此框架下，Romboutsia_B及其共現類群不應被視為單一的病原體，而應被視為與菌群失調相關的微生物群落和功能網絡的代表性成員。

因此，未來針對微生物組的干預措施可以超越單純抑制促炎類群和補充產SCFAs有益類群的線性策略。相反，諸如飲食調整、功能食品、益生菌和合生元等方法可能有助于在群落水平上增強SCFAs產生和屏障保護模塊，同時削弱Romboutsia_B相關的失調模塊，從而可能減輕肥胖相關的代謝負擔，并支持預防或延緩相關的認知和神經功能障礙。

本研究有幾個優點，但也存在一些局限性，包括主要依賴16S rRNA測序在屬水平進行解析、功能預測是推斷性的、僅使用雄性C57BL/6J小鼠以及作為觀察性研究無法確定因果方向等。

長期高脂飲食會誘導小鼠“口腔-腸道-肝臟-大腦”軸的系統性重塑。Romboutsia_B在口腔和腸道菌群中持續富集，并與肥胖、肝損傷、缺氧和認知障礙相關，而與代謝健康相關的菌屬則減少。這些變化與脂質和短鏈脂肪酸代謝的改變以及炎癥負荷增加有關，表明Romboutsia_B或可作為與肥胖相關肝-腦共病相關的非侵入性微生物標志物，值得在縱向和干預研究中進行驗證。