研究整合了來自同一批非小細胞肺癌（NSCLC）患者的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學（ST）數(shù)據(jù)。單細胞數(shù)據(jù)集包含19個樣本，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包含15個術后樣本，涵蓋了腫瘤核心、浸潤性腫瘤以及不同病理應答狀態(tài)的間質(zhì)區(qū)域。通過嚴格的質(zhì)控、批次效應校正和聚類分析，成功注釋了包括上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、髓系細胞、T細胞、B細胞、漿細胞等在內(nèi)的主要細胞群。髓系細胞中的巨噬細胞被進一步細分為五個亞群：CCL4L2⁺TAMs、CYP27A1⁺TAMs、FGL2⁺TAMs、LPL⁺TAMs和SPP1⁺TAMs。利用Robust Cell Type Decomposition (RCTD) 方法，將單細胞數(shù)據(jù)作為參考，對空間轉(zhuǎn)錄組斑點進行細胞類型解卷積，成功重建了高分辨率的空間細胞圖譜，為后續(xù)深入分析腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）奠定了基礎。

為了從細胞群落的角度理解TIME，研究使用ISCHIA（Identifying Spatial Co?occurrence in Healthy and InflAmed tissues）算法對空間斑點進行生態(tài)位分析，共識別出9個不同的空間生態(tài)位，稱為組成簇（Composition Cluster, CC1-CC9）。根據(jù)主要細胞類型、空間分布傾向和通路活性，這些生態(tài)位被歸類為四類：腫瘤富集生態(tài)位（CC2, CC4, CC6）、腫瘤-間質(zhì)生態(tài)位（CC7, CC8）、正常上皮富集生態(tài)位（CC5）以及免疫-間質(zhì)生態(tài)位（CC1, CC3, CC9）。PROGENy通路富集分析顯示，不同生態(tài)位具有 distinct 的功能狀態(tài)。值得注意的是，生態(tài)位9（CC9）富含效應細胞，且僅存在于對免疫檢查點阻斷（ICB）治療有應答的患者樣本中。相反，生態(tài)位4（CC4）和生態(tài)位6（CC6）作為腫瘤浸潤前沿的生態(tài)位，富含SPP1⁺TAMs、調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和肌成纖維樣癌癥相關成纖維細胞（myCAFs）等免疫抑制細胞，呈現(xiàn)出免疫排斥的景觀。這種基于空間生態(tài)位的量化分析，為比較不同治療響應下TIME的異質(zhì)性提供了一個可比較的基礎單元。

聚焦于腫瘤富集生態(tài)位，研究發(fā)現(xiàn)CC2是惡性細胞比例最高的生態(tài)位，呈現(xiàn)出典型的“免疫荒漠”狀態(tài)，嚴格存在于腫瘤核心。而位于腫瘤邊緣的CC4和CC6則是腫瘤浸潤的關鍵區(qū)域。細胞通訊分析（使用CellChat工具）表明，在CC4和CC6內(nèi)部，細胞間相互作用主要促進腫瘤遷移和細胞外基質(zhì)（ECM）重塑。例如，VEGF、COMP、ANGPTL2、CEACAM6等配體介導的相互作用促進了血管生成并抑制免疫反應；膠原-整合素信號通路和以SDC1（Syndecan-1）為中心的相互作用網(wǎng)絡則加劇了纖維化，為腫瘤浸潤創(chuàng)造了物理屏障。通過SPATA2構(gòu)建的從CC2經(jīng)CC6到CC4的空間軌跡分析顯示，沿此軌跡，基因表達和通路活性發(fā)生連續(xù)變化：CC2高表達與增殖相關的MYC靶標和氧化磷酸化通路；CC4則特異性上調(diào)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、血管生成等與浸潤相關的通路。關鍵基因如SDC1、ITGA2在腫瘤區(qū)域高表達，而COMP特異性地分布于腫瘤邊緣，并在空間上與CC4共定位，提示COMP-SDC1等相互作用可能在腫瘤浸潤中扮演關鍵角色。

對比不同治療響應組，研究發(fā)現(xiàn)富含效應細胞的生態(tài)位9（CC9）在應答者中顯著富集。深入分析CC9的細胞組成發(fā)現(xiàn)，其相較于其他免疫-間質(zhì)生態(tài)位（如CC1）含有更高比例的CD8⁺T細胞。相關性分析進一步指出，CYP27A1⁺TAMs與細胞毒性T淋巴細胞（CTL）活性呈最強正相關。在單細胞水平上，CYP27A1⁺TAMs在免疫治療應答者（MPR）中的比例顯著高于非主要病理應答者（NMPR）。功能分析顯示，盡管CYP27A1⁺TAMs不表達傳統(tǒng)的M1型巨噬細胞標志物，但其抗原呈遞相關通路（如MHC-I和MHC-II）的活性在所有巨噬細胞亞群中最高。生存分析表明，無論在TCGA-LUAD隊列中高表達CYP27A1基因，還是具有高的CYP27A1⁺TAMs特征評分，均與患者更好的總生存期（OS）顯著相關。細胞通訊和空間共定位分析為這一關聯(lián)提供了機制解釋：CYP27A1⁺TAMs通過MHC-I/II通路與CD8⁺T細胞進行抗原呈遞相互作用，并高表達趨化因子配體-受體對CXCL9-CXCR3。空間分析（使用Ripley‘s K函數(shù)和MISTY）證實，CYP27A1⁺TAMs與CD8⁺T細胞在空間上存在顯著的共定位傾向，且這種共定位廣泛存在于各個樣本中。此外，CYP27A1⁺TAMs還通過CD86信號通路廣泛激活CD8⁺T和CD4⁺T細胞（而非Tregs）。這些結(jié)果共同表明，CYP27A1⁺TAMs通過多途徑招募和激活CD8⁺T細胞，是其發(fā)揮抗腫瘤作用的核心機制。

為了探究免疫治療對CYP27A1⁺TAMs的調(diào)控作用，研究比較了治療前后該細胞亞群的基因表達和通路變化。結(jié)果顯示，治療后CYP27A1⁺TAMs的抗原呈遞能力并未進一步提升，但其抗凋亡相關通路被激活，且膽固醇代謝關鍵酶CYP27A1、肝X受體（Liver X Receptor， LXR， 由NR1H2和NR1H3編碼）及其下游靶基因（如ABCG1， ABCA1）的表達顯著上調(diào)。根據(jù)LXR表達水平，將CYP27A1⁺TAMs進一步分為LXR高表達（TAMs-LXRhi）和LXR低表達（TAMs-LXRlow）兩組。空間分布分析發(fā)現(xiàn)，TAMs-LXRhi在腫瘤樣本中的豐度顯著高于TAMs-LXRlow，并且在間質(zhì)樣本中，TAMs-LXRhi與CD8⁺T細胞的共定位更強。MISTY分析及隊列相關性分析均證實，TAMs-LXRhi與CD8⁺T細胞的空間關聯(lián)性和相關性顯著強于TAMs-LXRlow。此外，經(jīng)典LXR靶基因APOE等與CD8⁺T細胞標志物在TCGA隊列中呈正相關。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫治療后，CYP27A1⁺TAMs的LXR通路被激活，使其進入一個生存能力更強、招募CD8⁺T細胞能力更佳的“高功能”狀態(tài)。

研究的發(fā)現(xiàn)在多個獨立的外部數(shù)據(jù)集中得到了驗證。在單細胞數(shù)據(jù)集GSE131907和GSE223203中，確認了CYP27A1在肺組織巨噬細胞中的特異性高表達，且CYP27A1表達水平高的巨噬細胞顯示出最強的抗原呈遞能力和偏向β-氧化的代謝特征。利用這些單細胞數(shù)據(jù)對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（E-MTAB-13530和GSE267960）進行解卷積和注釋后，空間分析再次證實了CYP27A1表達與CD8⁺T細胞標志物在空間上的緊密關聯(lián)。此外，人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas）的數(shù)據(jù)顯示，CYP27A1在肺和胰腺的巨噬細胞中特異性高表達，且其所在的巨噬細胞功能簇（Cluster 58）的基因特征與本研究中的CYP27A1⁺TAMs高度相似，進一步佐證了該細胞亞群身份的穩(wěn)定性及其在先天免疫應答和脂質(zhì)代謝中的關鍵作用。

基于上述發(fā)現(xiàn)，研究旨在構(gòu)建一個可用于臨床預后預測的模型。通過篩選TCGA-LUAD隊列中腫瘤與正常組織的差異表達基因以及CYP27A1⁺TAMs的標志基因，取其交集獲得108個候選基因。經(jīng)過單變量Cox回歸分析，篩選出24個與預后顯著相關的基因。隨后，通過系統(tǒng)評估101種不同的機器學習算法組合，最終選擇在多個驗證隊列中平均C-index最高的Elastic Net（alpha=0.9）算法，構(gòu)建了CYP27A1⁺巨噬細胞風險評分（CMRS）模型。該模型包含7個保護性基因。在訓練集（TCGA-LUAD）和多個獨立驗證集（GSE13213, GSE31210, GSE42127, GSE50081及其合并的Meta隊列）中，CMRS模型均表現(xiàn)出穩(wěn)健的預后預測性能。KM生存分析顯示，根據(jù)CMRS中位數(shù)劃分的低風險組患者，其總生存期顯著優(yōu)于高風險組。時間依賴性ROC曲線證實了模型在1年、3年和5年生存率預測上的準確性。與已發(fā)表的多個預后模型相比，CMRS在大多數(shù)隊列中取得了更高的C-index，展現(xiàn)了其優(yōu)越的預測效能和臨床轉(zhuǎn)化潛力。