基因療法領域有望徹底改變醫學現狀，為包括中樞神經系統（CNS）疾病在內的多種疾病提供個性化治療方案。腺相關病毒（AAVs）作為基因療法的遞送載體被廣泛研究。然而，將基于重組AAV（rAAV）載體的基因療法應用于神經系統疾病，面臨著諸多挑戰，其中最關鍵的一環便是實現高效、安全的CNS遞送。這篇綜述旨在介紹并更新該領域的最新進展。

要抵達中樞神經系統的靶細胞，rAAV載體必須克服一系列物理屏障。首先是血腦屏障（BBB），它由毛細血管內皮細胞（BECs）構成，頂端通過緊密連接（TJs）相互連接，嚴重限制了分子和病毒從血液進入腦實質。此外，基底膜（BM）、細胞外間隙中的間質基質以及包裹神經元胞體和樹突的神經元周圍網絡（PNNs），都構成了遞送途中的阻礙。

AAV衣殼由60個病毒衣殼蛋白（VP1， VP2， VP3）原聚體組裝成二十面體結構，其與環境（包括靶細胞）的相互作用主要由衣殼表面的突起，特別是超變區（VR）IV和VIII介導。

rAAV載體主要通過受體介導的胞吞轉運（RMT）或小窩介導的胞吞轉運（CMT）等主動運輸方式穿過BECs。此外，在某些情況下，如使用甘露醇、聚焦超聲等方法暫時破壞BBB完整性時，也可發生細胞旁路運輸。

在開發用于CNS疾病的基因療法方面，AAV9血清型因其衣殼在天然AAV中具有相對較高的穿越人類BBB的能力而備受關注�；�于此開發的奧那西農原倍阿帕韋（onasemnogene abeparvovec，OA，商品名Zolgensma^?）是首個獲得FDA批準的用于治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）的AAV遞送基因療法。SMA是由運動神經元生存1（SMN1）基因缺失或功能障礙引起的神經肌肉疾病。

OA的成功臨床應用帶來了寶貴的經驗，但也凸顯了挑戰，包括劑量相關的毒性風險（如肝毒性、背根神經節感覺神經元病變）、療效的個體差異，以及長期療效和安全性（如SMN1基因可能被表觀遺傳沉默或在分裂細胞中被稀釋）的不確定性。

目前優化rAAV衣殼的方法主要可分為三類：理性設計、定向進化和計算機輔助設計。

理性設計通常依賴于通過定點誘變對rAAV衣殼進行靶向修飾，例如將表面暴露的酪氨酸或蘇氨酸替換為極性較小的苯丙氨酸或纈氨酸。也包括插入或交換已知功能的肽段序列，例如在AAV9中插入含有RGD基序的肽段獲得了主要靶向星形膠質細胞的衣殼AAV9P1。化學修飾和計算機模擬對接算法也為理性設計提供了支持。

定向進化通過構建多樣化的AAV衣殼變體庫，然后通過篩選過程分離和鑒定具有所需特性的衣殼。一些高效的篩選平臺包括基于Cre重組的AAV靶向進化（CREATE）、通過細胞類型特異性RNA表達重定向AAV（TRACER）以及利用體內轉基因RNA表達的AAV衣殼定向進化（DELIVER）。篩選出的候選衣殼還需進行靶點解析，以明確其轉導機制。

計算機輔助設計利用計算方法克服傳統理性設計的局限，包括基于系統發育分析的祖先重建（如Anc80L65衣殼）以及利用機器學習（ML）模型基于實驗數據設計具有所需特性的多樣化rAAV衣殼變體。例如，Fit4Function方法可以同時優化多個理想性狀（如高產率和高肝臟靶向性）。混合方法（如先定向進化篩選，再進行理性工程改造）也在應用。

研究已開發出多種具有改進腦靶向性或細胞類型特異性的rAAV衣殼。例如，通過CREATE方法篩選出的AAV-PHP.B及其衍生物在小鼠中顯示出強大的腦嗜性，但其效能依賴于小鼠Ly6a蛋白的表達，在靈長類動物中效果不佳。為克服物種差異，研究人員通過多物種篩選策略獲得了在舊大陸猴（如食蟹猴）中具有良好CNS嗜性的衣殼AAV.CAP-Mac。

其他有前景的衣殼包括在非人靈長類動物中篩選出的9P801，其肝臟和背根神經節靶向性低，而腦神經元靶向性高；靶向人轉鐵蛋白受體（TFR1）的BI-hTFR1衣殼；以及Sangamo Therapeutics開發的STAC-BBB衣殼，其在食蟹猴大腦中表現出優異的腦嗜性和顯著降低的周圍組織靶向性。

對于需要靶向特定細胞類型的疾病，也開發了相應的衣殼。例如，AAV-BR1和其衍生物AAV-BR1N分別靶向腦內皮細胞和神經元；AAV-MG1.1/1.2曾被報道靶向小膠質細胞，但后續研究對其特異性提出了質疑；AAV-X1.1主要靶向腦內皮細胞；而通過多種天然AAV衣殼序列洗牌和定向進化獲得的Olig001，則對少突膠質細胞表現出高特異性（>95%），可用于治療如Canavan病等脫髓鞘疾病。

如果缺乏具有特定細胞類型嗜性的衣殼，仍可通過使用細胞類型特異性啟動子或增強子元件來限制有效載荷的表達，從而實現細胞類型特異性。

在將基因療法靜脈注射給人類之前，必須測試其遞送載體克服人類BBB的能力。經典的體外分析模型是Transwell系統。更復雜的“芯片器官”3D細胞培養模型能在微流體通道中模擬腦血流的生理剪切應力，更真實地再現BBB微環境。

所有BBB模型系統的核心是在半透膜上生長緊密的內皮細胞（ECs）單層，模擬血管管腔的頂端腔室和模擬腦實質環境的基底外側腔室。屏障形成的程度可通過跨內皮電阻（TEER）測量來評估，也可通過檢測緊密連接蛋白的表達與分布、P-糖蛋白的極性定位以及熒光染料（如熒光素鈉、Lucifer Yellow）的旁細胞滲透性來直接評估屏障完整性。

用于構建BBB模型的人內皮細胞來源包括原代或永生化內皮細胞（如hCMEC/D3細胞系），以及由人誘導多能干細胞（hiPSCs）分化而來的內皮細胞。hiPSC來源的細胞具有更高的膜完整性（TEER值高），但將其分化為真正意義上的內皮細胞仍具挑戰。此外，血管化的類腦器官也被越來越多地用于新型rAAV衣殼的鑒定和腦靶向基因療法的臨床前評估。

鑒于即使在非人靈長類動物中，系統性給藥的rAAV載體也難以轉導大部分腦細胞，需要策略來規避這一限制。

一種策略是聚焦于病因具有強烈區域集中性的神經系統疾病。例如，亨廷頓病（HD）的病理進展受紋狀體影響巨大。通過MRI引導的手術將攜帶治療性微RNA（如靶向HTT基因的AMT-130）的AAV5載體直接注射到紋狀體及其附近的六個深部腦區，已在臨床試驗中顯示出延緩疾病進程的潛力。進一步使用對深部腦結構有選擇性嗜性的衣殼（如AAV-DB-3）可能提升療效。

另一種策略是依賴于旁觀者效應（CC）。該概念最初在溶酶體貯積癥（LSD）的治療中獲得關注。在CC中，可被現有方法轉導的細胞（如肝臟細胞或腦內皮細胞）被改造成“工廠”，分泌疾病校正蛋白，從而影響鄰近細胞。例如，通過靜脈注射靶向腦內皮細胞的AAV-BR1衣殼遞送Npc2基因，可在小鼠模型中廣泛恢復Npc2蛋白表達，緩解尼曼-匹克C2型病的癥狀。

對于阿爾茨海默病（AD），將保護性的APOE-ε2蛋白分泌到細胞外空間也是一種CC策略。臨床前研究表明，在AD小鼠模型中表達APOE-ε2可顯著減少Aβ斑塊密度和神經炎癥。Lexeo Therapeutics公司正在開展多項使用AAVrh10載體遞送APOE-ε2基因療法的臨床試驗。對于非天然分泌的蛋白，可通過蛋白質工程（如添加分泌信號肽和細胞穿膜肽）使其具備分泌和跨細胞能力，從而實現旁觀者效應。

盡管AAV9載體（如OA）取得了早期成功，但在臨床上靜脈注射rAAV載體治療CNS疾病仍面臨挑戰。目前，尚無臨床批準的基因療法使用經過CNS應用優化的rAAV衣殼。近期一項使用新型衣殼CAP-002的臨床試驗（SYNRGY研究）中發生了一起兒童死亡事件，這為整個領域敲響了警鐘，強調了深入理解載體安全性（包括免疫反應和基因組潛在的細胞毒性）的重要性。

然而，該領域的研究勢頭依然強勁。例如，Lexeo Therapeutics公司針對APOE-ε4純合子患者的AAVrh10-APOE-ε2基因療法臨床試驗已顯示出降低腦脊液tau生物標志物等積極信號。Sangamo Therapeutics公司則利用其高效的STAC-BBB衣殼遞送鋅指蛋白阻遏物（ZFRs），旨在降低朊病毒蛋白（PrP^C）或tau蛋白的表達，在臨床前模型中展現了強大的治療潛力，其針對朊病毒病的首個人體臨床試驗預計將于2026年啟動。

解決基因療法安全高效遞送至CNS的挑戰是一項緊迫而未滿足的需求。針對rAAV作為首選遞送載體的研究正在快速推進�，F在人們越來越認識到，即使對rAAV衣殼的微小改變也可能對其嗜性和跨物種效力產生深遠影響。同時，在進行臨床研究時，必須充分考慮年齡、給藥途徑和血清陽性狀態等多種因素。盡管存在挫折，但這項遞送平臺技術正日趨成熟。充滿希望的衣殼不斷涌現，它們能夠被純化到高滴度和高純度，可靶向已知的細胞攝取受體，具有外周脫靶性低和跨物種效力強等優點。機器學習等工具開始助力多性狀衣殼的優化。模塊化的任務性質使得協同合作和多個領域的漸進式進步成為可能。近期報道的番鴨AAV分離株AAV.div3A能夠逃避哺乳動物免疫系統，這為血清陽性患者或需要重復給藥的患者帶來了希望。實現rAAV的重復給藥將極大地拓寬其治療窗口。最終，一旦獲得滿足高標準要求的工具和方法，這些解決方案將有望用于遞送有效的基因療法，治療多種CNS疾病。