代謝相關脂肪性肝病（MAFLD）是一系列肝臟疾病的總稱，包括代謝相關脂肪變性肝病（MASLD）、代謝相關脂肪性肝炎（MASH）、纖維化、肝硬化和肝細胞癌（HCC）。全球MASLD患病率正在迅速上升，預計到2040年，成年人的患病率將超過55%。研究顯示，即使在正常體重指數（BMI）下，亞洲和西方人群也可能因內臟脂肪過度堆積而易患MAFLD。

盡管FDA在2024年批準了首個針對MASH的特異性藥物，但像糞便微生物移植（FMT）這樣的微生物群靶向療法作為輔助策略仍然具有研究價值。腸道-肝臟軸在代謝性疾病中扮演著核心角色，因此，腸道微生物群作為MAFLD的致病因素和治療靶點正受到越來越多的關注。腸道菌群與宿主之間的平衡有益于生物代謝系統的正常發育。人類結腸中寄居著數萬億微生物，它們不僅幫助消化，還調節免疫反應和宿主代謝。這種微生物生態系統的破壞，通常稱為菌群失調，被認為與MAFLD的發生和進展有關。

FMT是一種基于微生物組的治療策略，涉及將健康供體的腸道微生物群落轉移給受體，以恢復微生物平衡。FMT已顯示出在治療幾種與微生物群相關的疾病（如炎癥性腸病、復發性艱難梭菌感染、自閉癥和代謝綜合征）方面的潛力。研究表明，FMT通過調節腸道菌群，可能在改善肝功能和新陳代謝健康方面具有潛力。在MAFLD背景下，多項研究顯示FMT可以恢復微生物生態系統并減輕肝臟炎癥，從而為常規治療提供了有前景的輔助手段。與益生菌或合生元相比，FMT的優勢在于能夠傳遞更多樣化和更復雜的微生物種群。以往的研究表明，通過FMT恢復腸道菌群穩態可能對MAFLD患者的肝功能和新陳代謝健康有益。然而，大多數FMT在MAFLD模型中的臨床前研究依賴于抗生素預處理來消耗宿主菌群，這可能引入諸如微生物耗竭誘導的上皮損傷或改變的免疫反應等潛在混雜因素。此外，在飲食誘導的脂肪肝模型中，不使用抗生素預處理的FMT效果研究尚不充分。

本研究采用高脂高糖（HFCS）飲食誘導C57BL/6小鼠產生MAFLD，并探究源自健康供體的FMT是否能在不使用抗生素預處理的情況下逆轉肝臟和微生物的改變。我們的目標是評估FMT對肝臟炎癥、血清生物化學和腸道微生物組成的影響，以深入了解FMT在MAFLD中的治療潛力。

動物實驗由寧波大學醫學院動物研究倫理委員會審查并批準（批準號：AEWC-NBU20210012），并遵守機構規定和ARRIVE指南進行。雄性C57BL/6小鼠（Mus musculus，5-6周齡，體重20 ± 2 g）購自浙江維通利華公司，在21°C-22°C的無特定病原體條件下飼養。經過一周的適應期后，動物被隨機分配到三個實驗組（每組n=5）。本研究包括對照組、HFCS組和HFCS + FMT組。對照組喂食標準飲食，而HFCS組和HFCS + FMT組則接受高脂高糖飲食，該飲食由60%的熱量來自脂肪和42 g/L的糖水（55%果糖和45%蔗糖，w/w）組成。經過20周的HFCS飲食喂養后，對照組和HFCS組的小鼠通過灌胃給予200 μL無菌生理鹽水，而HFCS + FMT組則在8周內（共24次），每周三次給予新鮮制備的糞便微生物懸液（每次灌胃200 μL）。每周測量體重。在28周實驗結束時，收集新鮮糞便樣本用于后續微生物群分析。隨后麻醉小鼠并采集血液和組織樣本。

進行組織學分析。石蠟包埋的肝樣本進行蘇木精-伊紅（H&E）染色。在光學顯微鏡下檢查肝臟形態，并基于脂肪變性、小葉炎癥和肝細胞氣球樣變的綜合評估計算NAFLD活動度評分（NAS）。使用市售試劑盒定量血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和總膽固醇（TC）濃度。通過實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析肝組織中IL-1β和IL-17α的mRNA表達水平。

對于腸道菌群分析，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取每組樣本的DNA。靶向16S rRNA基因的V3-V4區域進行微生物群分析。使用HiSeq平臺進行雙端測序，并基于97%的相似性進行操作分類單元（OTU）聚類。

為了探究微生物群來源的代謝功能障礙的轉錄組學后果并驗證實驗觀察結果，分析了公共RNA-seq數據集GSE151220，該數據集分析了從去氫表雄酮（DHEA）誘導的菌群失調供體接受FMT后的小鼠肝臟基因表達譜。通過基于閾值（|log₂折疊變化| > 0.3，校正后P值<0.05）識別差異表達基因（DEGs）。使用clusterProfiler包進行功能富集分析。

數據分析以平均值 ± 標準誤表示，使用SPSS統計軟件進行統計分析。采用單因素方差分析，然后進行Tukey檢驗進行組間比較。P值小于0.05被認為具有統計學意義。

與對照組相比，HFCS組小鼠表現出肥胖、嗜睡和皮毛粗糙的跡象。經過8周的FMT干預，HFCS + FMT組顯示出整體健康狀況的改善，包括體重減輕和更光澤的皮毛。在28周實驗結束時，HFCS + FMT組的體重顯著低于HFCS組。與對照組相比，HFCS組的血清ALT和TC水平顯著升高，表明存在肝損傷和血脂異常。盡管FMT治療的小鼠在ALT和TC水平上顯示出持續的改善趨勢，但這些差異并未達到統計學顯著性。

在28周研究結束時進行了糞便微生物群分析。通過Chao1、Shannon和Simpson指數評估α多樣性。分析顯示，與對照組相比，HFCS組的Chao1、Shannon和Simpson值顯著降低。然而，在FMT干預后，HFCS + FMT組的這些數值有所增加。這些發現表明，MAFLD小鼠的腸道菌群多樣性降低，而FMT干預可以有效恢復腸道菌群多樣性。基于16S rRNA測序的主坐標分析揭示了三個組之間不同的微生物群落結構。HFCS組與對照組分離，而HFCS + FMT組則向對照組聚類靠攏。這些結果表明，FMT后微生物組成得到部分恢復。

在門水平上，與對照組相比，HFCS組顯示出厚壁菌門/擬桿菌門比率增加，而FMT部分逆轉了這一比率。在綱水平上，HFCS組中芽孢桿菌顯著富集。在屬水平上，雙歧桿菌在HFCS喂養的小鼠中明顯減少，但在HFCS + FMT組中增加。線性判別分析進一步確定了組間差異豐度的關鍵分類群，支持了FMT對腸道菌群組成的調節作用。

為了探索FMT干預后腸道微生物群的潛在功能差異，使用PICRUSt預測了微生物功能譜。在預測水平上，識別了與胰島素信號傳導相關的通路。

通過H&E染色對肝切片進行組織學檢查顯示，對照組肝臟結構正常，而HFCS組則表現出肝小葉結構破壞、肝細胞氣球樣變和炎性細胞浸潤。FMT治療顯著改善了肝臟組織學，表現為脂肪變性減少、脂肪空泡減少和肝索排列更規整。HFCS組的NAS評分顯著高于對照組，而在HFCS + FMT組中顯著降低。這些結果表明，FMT有效減輕了HFCS誘導的脂肪性肝炎。

為了研究肝臟炎癥反應，我們評估了肝組織中IL-1β和IL-17α的mRNA表達。這些基因被認為是肥胖和MAFLD發病機制中關鍵的促炎細胞因子。與對照組相比，HFCS組IL-1β mRNA水平顯著上調，而FMT治療后則顯著降低。類似地，HFCS喂養的小鼠IL-17α mRNA水平升高，但FMT后下降。這些發現表明，FMT與減輕肝臟炎癥和促炎細胞因子有關。

為了進一步支持實驗發現并研究微生物群操作對肝臟的轉錄組學影響，我們分析了公開可用的RNA-seq數據集GSE151220。該數據集使用了從DHEA誘導的菌群失調供體接受FMT的小鼠，這與HFCS誘導的MAFLD有很大不同。與我們使用健康供體FMT減輕肝損傷的研究相反，該數據集代表了相反的情景：來自菌群失調供體的FMT與代謝功能障礙相關。

FMT處理小鼠與對照小鼠之間的差異表達分析揭示了118個上調基因和140個下調基因。無監督聚類分析顯示，這些基因表達模式清楚地區分了兩組，突出了對菌群失調FMT的強烈轉錄反應。值得注意的是，諸如MRPS21、SCML4、ZNF302和ZNF346等基因顯著上調，而ACTN4、CHST2、CTNNA1、MICU1、RNF40和TPP1等基因在FMT組中顯著下調。

上調基因的GO和KEGG通路富集分析表明，在細胞酮代謝、膽固醇代謝和甘油三酯生物合成調節等相關通路中顯著富集。相反，下調基因與藥物反應、細胞外基質組織和細胞對生物刺激的反應相關，這些生物學過程是公認的MAFLD發病機制特征。

隨著全球飲食向高脂高糖轉變，MAFLD已成為最普遍的慢性肝病。MAFLD與肥胖和胰島素抵抗密切相關。在本研究中，我們使用HFCS飲食建立了MAFLD小鼠模型，該模型密切模擬了人類疾病的病理生理特征。先前的研究表明，腸道菌群失調在MAFLD和MASH的進展中起著關鍵作用。來自MASH患者的腸道微生物群移植到無菌或抗生素處理的小鼠中會加劇肝臟脂肪變性和炎癥，這強調了微生物群的致病作用。然而，大多數FMT在MAFLD模型中的臨床前研究依賴于抗生素預處理來消除內源性菌群，這可能會引入混雜因素。相比之下，我們的研究采用了一種更溫和、更具轉化意義的方法，沒有進行先前的抗生素治療，從而保留了宿主的天然菌群環境并最大程度地減少了混雜因素。

我們的結果表明，FMT與部分逆轉HFCS誘導的菌群失調有關，其特征是厚壁菌門/擬桿菌門比率降低和雙歧桿菌豐度增加。這些微生物特征與肥胖和MAFLD模型中的代謝狀態相關。厚壁菌門/擬桿菌門比率被認為是腸道菌群失調的可能生物標志物。先前的研究表明，與厚壁菌門相關的微生物平衡的改變可能作為肥胖相關代謝失調的指標。在HFCS中顯著富集的糞便芽孢桿菌已被報道與自助飲食喂養的大鼠血清脂肪酸呈正相關。然而，芽孢桿菌在MAFLD中的作用尚未完全闡明。在HFCS中耗竭的有益菌屬雙歧桿菌在FMT治療的小鼠中得到恢復。先前的研究表明，雙歧桿菌可以降低腸道通透性和炎癥，表明其在維持代謝健康中的關鍵作用。

為了支持我們研究結果的生物學相關性，我們分析了一個公共RNA-seq數據集（GSE151220），其中小鼠接受了來自代謝不健康供體的FMT。與我們使用健康供體的模型相反，在該數據集中，菌群失調的FMT與脂質代謝和細胞外基質組織相關的肝臟轉錄組改變有關，這些過程涉及MAFLD的發病機制。從瘦供體到肥胖患者的FMT導致了腸道微生物組和膽汁酸譜的持續變化，這些變化與瘦供體相似。這些觀察結果強調了供體微生物群組成對肝臟基因表達的影響，并為我們研究中觀察到的健康供體FMT的潛在益處提供了間接的背景支持。

組織學分析顯示，FMT干預減少了脂肪變性和小葉炎癥，這體現在NAS評分的降低。同時伴隨著肝臟促炎細胞因子IL-1β和IL-17α的下調，其中IL-17α是MAFLD進展的潛在驅動因子。這些結果表明了FMT、減輕肝損傷以及調節腸道-肝臟軸免疫之間的關聯。

此外，我們的研究表明，在不使用抗生素預處理的情況下進行長期FMT可以改善飲食誘導的MAFLD模型中的肝臟病理并重塑腸道菌群。據報道，MAFLD疾病進展在不同品系間差異很大。本研究中選擇C57BL/6小鼠是因為它們在飲食誘導的MAFLD研究中被廣泛使用和充分表征。然而，其他品系可能表現出不同的代謝反應，不能排除品系依賴性效應。此外，脂質代謝、免疫調節和腸道菌群組成方面的物種特異性差異限制了將小鼠研究結果直接轉化為人類應用。因此，本研究結果應被視為假設生成性的，而非直接預測臨床療效。

本研究僅使用雄性小鼠，以盡量減少與動情周期相關的變異性，并確保代謝表型的一致性。重要的是，越來越多的證據表明，對飲食誘導的代謝性肝病的易感性在性別之間存在顯著差異。此外，潛在的分子機制也因性別而異。鑒于這些既定的性別依賴性差異，本研究中僅使用雄性小鼠旨在減少生物異質性，并關注在MAFLD模型中對肝損傷具有較高易感性的表型。然而，這一設計選擇限制了研究結果的普適性。

此外，我們的研究未包括用于評估肝脂肪積累和纖維生成的脂質特異性染色或纖維化特異性染色。缺少對脂肪變性分級和纖維化的詳細評估是本研究的一個局限性。因此，組織學結論應被視為初步的。相對較小的樣本量限制了統計效力，特別是對于血清生化參數如ALT和TC。盡管FMT在改善ALT和TC水平方面顯示出趨勢，但這些變化在統計學上不顯著。這可能歸因于FMT治療持續時間較短，可能不足以在血清生化指標上產生顯著變化。因此，這些發現應被解讀為指示性趨勢，而非確鑿證據。我們未在菌株水平上直接量化定植效率。成功的微生物群轉移是從整體組成變化推斷出來的，而不是直接的供體菌株追蹤，這是當前研究的另一個局限性。未來的研究需要納入這些參數和更大的樣本量，以驗證FMT的治療效果。

總之，本研究表明，在不使用抗生素預處理的情況下進行長期FMT，與HFCS誘導的MAFLD小鼠模型中的腸道菌群組成和肝臟病理學部分改善有關。雖然組織學和炎癥標志物得到有利改變，但由于樣本量有限和方法學限制，生化和機制研究結果仍屬探索性。這些結果為微生物群靶向干預作為MAFLD輔助策略的進一步研究提供了支持。