《Frontiers in Aging》：Ectoine attenuates H2O2-Induced cellular senescence in human keratinocytes and endothelial cells by modulating the p53/p21 and p16 pathways
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本綜述通過體外實驗評估了滲透壓補償性溶質Ectoine對H2O2誘導的人永生化角質形成細胞（HaCaT）和內皮細胞（EA.hy926）氧化應激衰老的抑制作用及其皮膚安全性。研究表明，Ectoine能通過下調p53/p21和p16信號通路、降低活性氧（ROS）水平、減少細胞凋亡并維持核纖層蛋白B1（Lamin B1）表達，有效減輕細胞衰老表型。這為Ectoine在抗細胞衰老（特別是皮膚衰老）領域的研究和應用提供了實驗依據。
背景
隨著人們年齡增長，對皮膚狀態的關注與日俱增，皮膚皺紋是典型的與衰老相關的現象。皮膚衰老過程可分為內源性衰老和外源性衰老。細胞衰老是衰老的關鍵驅動因素，可由多種應激源觸發，包括活性氧（ROS）和環境因素。多項研究已在動物和體外模型中進行了與皮膚衰竭相關的衰老生物標志物及相關機制通路的研究。暴露于UVB光的皮膚相關細胞（例如角質形成細胞）會表現出DNA損傷、細胞周期停滯，并表達衰老生物標志物，如衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增加；TP53、CDKN1A和CDKN2A激活；以及Lamin B1表達下調。p16的表達在紫外線照射后以及響應H2O2誘導的氧化應激時會迅速上調。據報道，幾種天然植物提取物，如根皮素、沒食子酸和非索非那定，對人皮膚角質形成細胞中的β-半乳糖苷酶活性、ROS水平以及p53和p16表達具有抑制作用，從而延緩衰老。
Ectoine是一種相容性溶質，首次于1985年在嗜鹽光合紫色細菌中發現并結構表征。其保護大分子的機制基于“優先水合”效應，通過在蛋白質周圍形成水殼（Ectoine-水復合物）來保護細胞膜免受干燥誘導的反應和隨后的炎癥反應。此外，細胞膜水合作用的增加改善了脂質層的流動性和功能性，Ectoine還能促進水分子簇的形成。因此，優先排斥模型將Ectoine的穩定作用歸因于周圍水結構的改變，這不僅能維持細胞內外的滲透壓，還能增加含水量。Ectoine不僅能維持細胞內外的滲透壓，增強對極端條件的抵抗力并減少經皮水分流失，還能通過在惡劣環境條件下保護整個細胞和生物大分子而具有細胞穩定作用。它還能保護細胞免受氧化損傷，并具有良好的應激保護、功能維持和抗炎特性。最近的研究報道，Ectoine可作為護膚品（如美白、保濕、抗衰老和紫外線防護產品）的添加劑。因此，Ectoine在生物醫學開發等領域具有非常好的應用潛力。
HaCaT細胞是源自人皮膚角質形成細胞自發轉化的永生化細胞系，其生理特性與皮膚角質形成細胞非常相似，長期以來在皮膚研究領域被視為可靠且穩定的細胞系。EA.hy926內皮細胞作為人臍靜脈內皮細胞的融合細胞系，更接近HUVECs且易于體外培養。因此，這些細胞近年來被研究人員廣泛采用。
材料與方法
本研究中使用的Ectoine購自Damas-beta。HaCaT細胞購自上海富恒生物技術有限公司。EA.hy926細胞由中藥和藏藥抗腫瘤課題組友情提供。
細胞以2×105個細胞/毫升的密度接種在適當的培養板中。當細胞匯合度達到約60%時，根據實驗設計進行分組和處理。所有細胞均在37°C、5% CO2的培養箱中培養。
通過CCK-8測定評估細胞毒性。用Ectoine或H2O2處理后，向每孔加入10微升CCK-8溶液并孵育0.5小時。使用酶標儀在450納米處測量吸光度。
使用EdU細胞增殖試劑盒根據制造商說明評估細胞增殖。簡言之，細胞經處理后，與EdU溶液孵育2小時，固定并用Apollo染料染色。細胞核用Hoechst 33342復染。使用熒光顯微鏡獲取圖像，并使用ImageJ軟件將EdU陽性細胞數與總細胞數的比值計算為增殖率。
使用SA-β-gal染色試劑盒根據制造商方案檢測細胞衰老。處理后，細胞在室溫下用固定液固定15分鐘，并與染色液在37°C、無CO2的條件下孵育過夜。衰老細胞通過在光學顯微鏡下呈現藍色染色來識別。
使用DCFH-DA熒光探針測量細胞內ROS水平。處理后，細胞與10微摩爾/升DCFH-DA在37°C孵育20分鐘，然后用PBS洗滌，隨后立即使用熒光顯微鏡測量熒光強度。使用ImageJ軟件進行定量分析。
使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green Premix在實時PCR系統上進行定量PCR。基因表達水平以內參β-肌動蛋白（β-actin）標準化，并使用2(-ΔΔCt)方法計算。
使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，并使用BCA測定法測定蛋白質濃度。蛋白質通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，膜在4°C下與抗p53、p21、p16和β-actin的一抗孵育過夜，隨后與HRP偶聯的二抗孵育。使用ECL底物顯影蛋白條帶，并使用ImageJ軟件進行定量。
在蓋玻片上生長的細胞用4%多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100透化，并用5% BSA封閉。樣品在4°C下與抗Lamin B1的一抗孵育過夜，隨后與熒光二抗孵育。細胞核用DAPI復染，并使用熒光顯微鏡捕獲圖像。
使用膜聯蛋白V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒根據制造商說明檢測細胞凋亡。處理后，收集細胞，重懸于結合緩沖液中，并與膜聯蛋白V-FITC和PI在室溫避光條件下染色15分鐘。在1小時內通過流式細胞術分析凋亡率。
數據以三個獨立生物學重復的平均值±標準差表示。使用Shapiro-Wilk檢驗評估數據分布的正態性。組間差異通過單因素方差分析，然后進行Tukey事后檢驗進行多重比較。P值小于0.05被認為具有統計學意義。所有統計分析均使用SPSS 22.0進行。圖表使用GraphPad Prism 9生成。
結果
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細胞毒性和形態評估
為評估Ectoine的生物安全性，通過CCK-8測定檢測了其處理24小時后對HaCaT角質形成細胞和EA.hy926內皮細胞的潛在細胞毒性。結果顯示，與對照處理相比，濃度范圍在0.25至2微摩爾/升的Ectoine處理并未顯著降低任一細胞類型的細胞活力，表明在該劑量范圍內Ectoine無細胞毒性。形態學觀察進一步證實了這些發現，與對照細胞相比，Ectoine處理的細胞保持了正常的細胞結構，沒有觀察到異常。值得注意的是，在顯微鏡評估下，Ectoine處理組的細胞密度有所增加，這表明其可能具有促增殖效應，值得通過EdU測定進一步研究。
- 2.
H2O2誘導的衰老模型的建立
為了建立氧化應激誘導的衰老模型，HaCaT和EA.hy926細胞暴露于濃度梯度為100-400微摩爾/升的H2O2中處理1或2小時。該處理誘導了兩種細胞系可辨別的形態學改變，例如細胞數量減少。H2O2處理以濃度依賴性方式抑制了兩種細胞系的活力。基于對應于約70%-80%細胞活力的常規衰老標準，選擇200微摩爾/升H2O2處理1小時和100微摩爾/升H2O2處理2小時的條件分別誘導HaCaT和EA.hy926細胞的衰老，這些條件用于所有后續實驗。
- 3.
Ectoine促進增殖并降低衰老相關β-半乳糖苷酶活性
為了確定Ectoine是否能減輕H2O2誘導的增殖停滯，我們進行了EdU摻入實驗。細胞在預定的最佳衰老誘導條件下，在H2O2暴露前用Ectoine預處理24小時。定量分析表明，Ectoine預處理顯著抵消了氧化應激的抗增殖作用。與H2O2處理組相比，0.5和1微摩爾/升Ectoine顯著增加了HaCaT和EA.hy926細胞中EdU陽性細胞的百分比，表明其有效恢復了增殖能力。這種劑量依賴性的DNA合成增加突出了Ectoine在氧化應激下促進細胞復制的作用。
與衰老表型一致，與對照處理相比，H2O2刺激顯著增加了SA-β-gal陽性HaCaT和EA.hy926細胞的比例。值得注意的是，用0.5和1微摩爾/升Ectoine預處理顯著減弱了這種H2O2誘導的SA-β-gal活性增加，證明了其改善應激誘導的過早衰老的強大能力。
- 4.
Ectoine降低細胞內ROS水平并維持Lamin B1表達
我們通過測量H2O2誘導氧化損傷后的細胞內ROS水平，研究了Ectoine的抗氧化潛力。H2O2暴露在兩種細胞類型中都誘導了顯著的ROS積累。然而，用0.5微摩爾/升Ectoine預處理顯著減弱了這種氧化爆發，將ROS水平降低到與對照組相當的水平。這些結果表明，Ectoine有效清除了角質形成細胞和內皮細胞中的氧化應激。
鑒于核膜完整性的喪失是衰老的一個標志，我們通過免疫熒光評估了Lamin B1的表達。與對照處理相比，H2O2處理顯著降低了Lamin B1與DAPI的熒光強度比值，表明核膜完整性被破壞。Ectoine預處理顯著恢復了Lamin B1的表達，表明它在維持核結構和減輕DNA損傷反應激活方面發揮作用。
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衰老相關基因表達的qRT-PCR分析
qRT-PCR分析顯示，H2O2誘導的氧化應激顯著上調了兩種細胞系中關鍵衰老相關基因TP53、CDKN1A和CDKN2A的mRNA表達。Ectoine預處理有效抑制了這種H2O2觸發的上調。具體而言，0.5微摩爾/升Ectoine最有效地下調了HaCaT細胞中的mRNA表達，而在EA.hy926細胞中，0.5-1微摩爾/升Ectoine最有效地抑制了mRNA表達，表明其在氧化應激下有效抑制了核心衰老通路。
鑒于ROS驅動的細胞外基質（ECM）降解是細胞衰老的一個關鍵特征，我們檢測了Ectoine對基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9的影響。H2O2暴露顯著上調了兩種細胞類型中MMP9的mRNA表達以及EA.hy926細胞中MMP2的表達。相反，在EA.hy926細胞中，0.5微摩爾/升Ectoine顯著抑制了MMP2和MMP9的表達，這表明存在細胞類型特異性的ECM降解調控。
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Ectoine下調衰老相關蛋白表達并抑制細胞凋亡
蛋白質印跡分析證實了Ectoine在蛋白質水平上的調節作用。雖然H2O2處理傾向于增加p16、p21和p53蛋白的表達，但Ectoine預處理顯著逆轉了這種增加。在兩種細胞系中，0.5微摩爾/升Ectoine最有效地抑制了蛋白表達，表明Ectoine在氧化應激條件下有效抑制了衰老相關蛋白的表達。
使用膜聯蛋白V-FITC/PI染色的流式細胞術分析表明，H2O2顯著增加了HaCaT和EA.hy926細胞的凋亡。Ectoine預處理以濃度依賴性的方式顯著減弱了H2O2誘導的細胞凋亡，證實了其對抗氧化應激誘導的細胞死亡的保護作用。
討論
在本研究中，我們證明了H2O2處理成功誘導了HaCaT角質形成細胞和EA.hy926內皮細胞的細胞衰老，表現為SA-β-gal活性增加、細胞內ROS水平升高、衰老相關標志物表達上調以及Lamin B1表達減少。用Ectoine預處理，特別是在0.50微摩爾/升濃度下，以濃度依賴性的方式顯著減輕了這些衰老相關的改變。
細胞衰老可由氧化應激觸發，例如暴露于H2O2，導致不可逆的細胞周期停滯和特征性表型變化。在本氧化應激誘導的細胞衰老模型中，SA-β-gal活性的增加和衰老標志物的上調證實了細胞衰老的成功建立。Ectoine預處理顯著降低了SA-β-gal陽性率，并抑制了p53、p21、p16和MMPs的表達，同時維持了Lamin B1的水平。這些結果表明，Ectoine有效抵消了H2O2誘導的皮膚相關細胞的過早衰老。
過量的ROS是衰老的關鍵驅動因素。研究表明，芒果苷等天然化合物可以通過調節ROS和MMP水平，延緩H2O2誘導的皮膚相關細胞的衰老。在我們的模型中，Ectoine預處理顯著降低了細胞內ROS水平，并減少了兩種細胞類型的凋亡。值得注意的是，雖然凋亡和衰老代表了不同的細胞結局，但Ectoine對H2O2誘導的細胞凋亡的抑制可能有助于細胞在氧化應激條件下的整體存活。在HaCaT細胞中觀察到的更明顯的抗凋亡效應表明細胞類型對Ectoine治療的反應存在特異性。
p53/p21和p16通路是細胞衰老的核心調節因子。TP53被DNA損傷激活，主要通過其下游靶點CDKN1A誘導細胞周期停滯，而CDKN2A則有助于維持持續的增殖停滯。我們的數據顯示，Ectoine下調了H2O2處理細胞中p53、p21和p16的mRNA和蛋白表達。基于現有證據，我們提出了兩種非排他性的機制可能性：Ectoine可能通過其抗氧化特性在上游發揮作用，減少初始的氧化DNA損傷；或者在下游，在損傷發生后抑制衰老信號通路。觀察到的ROS水平降低支持了潛在的上游效應，而對p53/p21和p16表達的調節與下游效應一致。我們認為我們的發現代表了“機制關聯”而非直接的機制證明。未來的工作必須結合siRNA和γH2AX/53BP1灶點分析，以辨別Ectoine的保護作用是通過ROS介導的DNA損傷預防發生在上游，還是通過對p53/p16通路的調節發生在下游。
值得注意的是，Ectoine在各種生理模型中，包括腸道炎癥模型，已顯示出顯著的屏障保護和抗炎作用。其潛在機制——例如抑制經典促炎信號通路的激活以及降低關鍵促炎介質的水平——與皮膚光老化和氧化應激觸發的細胞內信號級聯反應密切相關。本研究的結果證實，Ectoine有效減輕了H2O2誘導的皮膚相關細胞衰老，這種益處可能根植于其對核心炎癥和應激通路的廣泛調節能力。因此，在腸道模型中觀察到的屏障修復和抗炎特性為Ectoine在皮膚相關細胞抗衰老策略中的應用提供了強有力的理論支持和新的研究思路，特別是針對炎癥性衰老和皮膚屏障功能受損的策略。雖然我們的研究通過MMP2/9分析為Ectoine對關鍵衰老標志物的影響提供了證據，但未來的研究應包括MMP活性的蛋白質水平驗證和更廣泛的衰老相關分泌表型分析，以全面表征衰老相關分泌表型。Ectoine在HaCaT和EA.hy926細胞之間的細胞類型特異性功效差異可能歸因于應激反應機制或通路激活的差異，值得進一步研究。此外，氧化應激與其他細胞死亡機制之間的關系也值得關注。最近的研究使用包括細胞模型和體內系統在內的多級實驗驗證方法，證明了鐵死亡在衰老和損傷模型中的作用，這為理解Ectoine的潛在保護機制提供了更廣泛的背景。
Ectoine以其穩定生物大分子和在極端條件下保護細胞的能力而聞名。盡管我們的研究側重于衰老相關基因的表達，但其潛在機制可能涉及“優先水合”，以及與ERK1/2、JNK和P38 MAPK等信號通路的相互作用，值得進一步研究。鑒于其抗炎和膜穩定特性，Ectoine的效用可能擴展到神經保護領域，特別是在阿爾茨海默病中，該疾病涉及氧化應激、蛋白質錯誤折疊和炎癥。未來的工作應采用先進的模型，例如Aβ處理的神經元培養物或轉基因阿爾茨海默病模型，以驗證其在神經系統中的功效。總之，Ectoine有效抵消了H2O2誘導的皮膚相關細胞衰老，支持了其在抗衰老護膚方面的潛力。此外，其多效性機制，包括生物大分子穩定、抗聚集和通路調節，表明其在解決神經衰老及相關疾病方面具有廣闊的轉化價值，值得開展跨學科研究。
