豆科植物的根瘤共生固氮是生物圈中固定氮的重要來源之一。根瘤菌（如苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti）在根瘤感染細胞（symplast）中暫時定殖形成菌落，并利用宿主細胞資源，在誘導氮酶（nitrogenase）后開始固定大氣中的氮。共生關系的終止，即“根瘤衰老”，表現為感染細胞的裂解。在細胞水平上，感染細胞的壽命相對較短（約3-6周），且根瘤對環境脅迫高度敏感。感染細胞壽命短的原因尚不完全清楚，可能與離子（如鉀離子）平衡缺陷有關。鉀（K⁺）是植物適應非生物脅迫的關鍵離子之一，對細胞的滲透狀態和陰陽離子平衡至關重要。鉀在細胞中的可利用性取決于膜兩側的鉀轉運和濃度。本研究旨在闡明宿主植物鉀轉運蛋白介導的鉀轉運與類菌體（bacteroids）內鉀轉運之間的相互依賴性，為此創建并分析了細菌鉀離子轉運蛋白 Smkup1的缺失突變體，并研究了根瘤衰老和自噬誘導過程中相關基因的表達變化，以識別共生終止的潛在機制。

研究使用截形苜蓿 (Medicago truncatula) Jemalong A17栽培品種，接種苜蓿中華根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti) Sm2011菌株或其 Smkup1突變體。通過基因替換技術構建了 S. melilotiKup1轉運蛋白的缺失突變體，并利用定量PCR（qPCR）驗證了突變背景下的基因表達缺失。通過分光光度計測量了對照菌株和突變菌株在LB液體培養基中的生長動力學。種植8周后，測量了每株植物的根瘤重量。使用實時定量PCR（qPCR）分析了宿主植物和根瘤菌的應激響應基因（如 MtCP5、RPoE2）以及自噬通路基因（如 ATG1、ATG2、ATG8、ATG9）的表達水平。通過光學顯微鏡和電子顯微鏡分析了根瘤的解剖結構和超微結構。利用STRING數據庫對自噬的正負調節因子（如Beclin 1、NAC1、BAK1）進行了蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的 in silico分析。

突變體 Smkup1的構建通過qPCR得到驗證，突變背景中 kup1基因表達缺失。細菌生長動力學分析顯示，與野生型對照菌株Sm2011相比，突變菌株在培養48小時和72小時后生長速率顯著滯后。然而，突變并未對根瘤生長產生負面影響，接種8周后，突變體誘導的根瘤重量與野生型相比沒有顯著差異，也未觀察到快速衰老的表型（如形成綠色的豆血紅蛋白分解區）。細胞學分析表明，Smkup1突變體誘導的根瘤在組織學或解剖學上未顯示明顯缺陷，也未形成特定的早期衰老表型。電子顯微鏡觀察顯示，突變體與野生型誘導的根瘤在固氮區感染細胞的超微結構沒有顯著差異，未發現共生終止或微生物快速裂解消除的位點。固氮能力指示基因 NifH的表達在突變體和野生型誘導的根瘤中無顯著差異。

為了評估突變誘導根瘤的脅迫水平，分析了微生物共生體和宿主脅迫及衰老相關基因的表達。結果表明，與野生型對照相比，突變體誘導的根瘤中細菌脅迫標記基因 RPoE2（一種包膜脅迫響應σ因子）的表達顯著上調，表明根瘤菌處于脅迫狀態。同時，宿主植物脅迫響應基因 MtCP5（一種半胱氨酸蛋白酶編碼基因，作為根瘤衰老標記）的表達也顯著上調，反映了宿主細胞的脅迫響應。

值得注意的是，與應激響應基因上調的趨勢相反，自噬通路基因的表達在突變誘導的根瘤中顯示出下調趨勢。低水平表達的自噬基因 ATG1、ATG2和 ATG9的表達有下降趨勢，而高水平表達的自噬基因 ATG8的表達在突變誘導的根瘤中出現了統計學上的顯著下調。為了闡明根瘤發育過程中自噬調控的途徑，利用Symbimix數據庫 in situ分析了自噬調控基因在 M. truncatula根瘤不同發育區的表達水平。結果顯示，自噬的正調控因子（如 Beclin1、SnF、WRKY20、Dhh1）在成熟的固氮區高表達，可能表明該區域存在能量限制。參與自噬體發育和成熟的基因（如 TGA9、WRKY24、WRKY33）在根瘤頂端區域表達。而自噬抑制基因（如 SOC1、PP2A、NAC1、TORC、BAK1）則在不同的根瘤區域上調表達，暗示存在發育階段特異性的調控。

為了識別根瘤中自噬基因的潛在調控途徑，對自噬的正負調控因子進行了蛋白質-蛋白質相互作用的 in silico分析。對自噬核心正調控因子Beclin-1的分析顯示，其互作蛋白網絡包括一個PI3K磷脂酰肌醇3-激酶（自噬相關蛋白）、酪氨酸激酶蛋白、鈣依賴激酶蛋白、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白、自噬相關蛋白3（ATG3）、參與細胞質到液泡運輸的泛素樣蛋白ATG12，以及一個紫外線輻射抗性相關蛋白。對負調控因子NAC1（一個NAC結構域轉錄因子）的分析顯示，其互作蛋白主要涉及對生長素等激素的響應、氮缺乏以及對有機物質和化學物質的響應。值得注意的是，該網絡中有多個蛋白與共生相互作用、細胞脅迫響應、程序性細胞死亡（PCD）和根瘤衰老相關，例如一個STAY-GREEN蛋白（MtSGR），它參與根瘤發育和衰老。對另一個負調控因子BAK1（一種BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1相關受體激酶1）的分析顯示，其互作蛋白網絡涉及激素（油菜素內酯、生長素）介導的信號通路調節、信號轉導以及對含氧化合物的響應。特別的是，該網絡中的多個蛋白參與了對細菌防御反應的負調控、細胞死亡的負調控以及植物-病原體互作。對正調控因子 Beclin1基因的表達分析顯示，其在野生型菌株誘導的根瘤中的表達顯著高于突變體誘導的根瘤。

在豆科-根瘤菌共生過程中，大量活細菌在根瘤細胞的共質體中維持數周，這對于任何真核生物來說都是極為罕見的現象。維持這種菌落會改變感染細胞的生物學特性，并可能是其壽命較短的原因之一。宿主細胞鉀離子轉運蛋白（如MtAKT1和MtSKOR/GORK）的錯位導致感染細胞內鉀含量降低，可能影響細胞穩態。本研究通過分析細菌鉀離子轉運蛋白 Smkup1的突變體，探討了共生伙伴在根瘤鉀轉運中的作用。雖然該單基因突變未導致根瘤結構損傷或共生體的快速衰老，但在沒有可見異常的情況下，根瘤表現出高水平的脅迫響應基因表達，同時自噬誘導相關的ATG基因表達下調。

自噬是細胞在能量缺乏、營養限制或存在微生物等不利條件下誘導的“管家”過程。一般認為，細菌進入真核細胞會觸發保護性反應，表現為自噬過程的誘導。在動物病原體感染中，會形成細菌包含空泡（bacteria-containing vacuoles），其膜上標記有RAB家族小GTP酶（如RAB7、RAB24）和特定的多磷酸肌醇，以確定膜/細胞器身份和膜融合。這些空泡最終會與具有裂解特性的自噬體融合，該過程由RAB7 GTP酶和同型融合及蛋白分選復合體（HOPS）的效應蛋白VPS11和VPS15協調。有趣的是，根瘤中的共生體膜在結構上與細菌包含空泡有許多共同點，它們也招募小GTP酶RAB7和SNARE蛋白。然而，由于感染細胞中這些效應蛋白的表達被強烈下調，HOPS效應蛋白VPS11和VPS15向共生體膜的募集受到抑制，使得共生體暫時免受自溶。

本研究顯示，自噬通路基因在根瘤所有區域都有表達，但在野生型根瘤的感染細胞中并未診斷到“經典形式”的自噬體。在 Smkup1突變體誘導的根瘤中，自噬清除過程更像是被抑制而非上調，這暗示即使在不利條件下，維持細菌菌落存在的可能性依然存在。盡管感染細胞可能處于糖水平不理想、鉀等離子水平不足、低氧等次優狀態，它仍能支持固氮細菌菌落長達6-8周，盡管這可能以犧牲其自身壽命為代價。

根據 in situ表達分析，自噬關鍵調控基因（如 Beclin1、SnF和 Dhh1）在根瘤固氮區高表達，暗示該區域存在饑餓環境以及自噬的誘導。特別有趣的是，參與自噬體成熟的基因 WRKY20在根瘤細胞中表達，盡管在這些細胞中從未發現過自噬體。自噬體膜的形成依賴于宿主膜，主要是內質網膜。值得注意的是，共生體膜也是由宿主細胞內質網形成的。如何調和解釋根瘤中相對較高的自噬基因表達水平與細胞中“經典”自噬體的缺失，目前尚不清楚。根瘤中防止共生體自噬清除和誘導感染細胞死亡的機制也尚未明了。

我們可以假設，根瘤中的自噬調控可能至少部分依賴于蛋白質的構象而非基因。為了識別根瘤中自噬調控的潛在途徑，我們基于已識別的自噬通路基因進行了蛋白質-蛋白質相互作用的 in silico分析。正調控因子Beclin1與參與自噬通路和細胞質到液泡運輸的泛素樣蛋白ATG12相關聯，而這些過程在感染細胞中部分受到抑制。負調控因子NAC1的互作網絡涉及程序性細胞死亡、脅迫響應以及調控根瘤發育和衰老的STAY-GREEN蛋白。負調控因子BAK1的互作網絡則涉及對細菌防御反應的負調控和細胞死亡的負調控，其在防止共生細胞中細菌被清除方面的作用可能至關重要。

關于根瘤感染細胞中蛋白質-蛋白質相互作用的數據，以及共生體形成與自噬體形成之間的某些相似性，使我們推測自噬通路可能被“征用”到共生形成過程中，并且該過程的調控在脅迫條件下可能非常重要。這可能暗示自噬基因在共生過程中發生了新功能化，可能參與了固氮共生體形成后的細胞內容納后期階段，并成為調控共生體維持的有用工具。本研究為通過調控這些基因的表達來延長根瘤壽命和固氮過程的持續時間提供了理論基礎和新思路。