免疫檢查點阻斷（ICB）療法改變了癌癥治療格局，但其療效高度依賴于腫瘤突變負荷（TMB）和腫瘤浸潤淋巴細胞的存在，對于微衛(wèi)星穩(wěn)定結(jié)直腸癌（MSS-CRC）、三陰性乳腺癌（TNBC）等弱免疫原性腫瘤效果有限。治療性癌癥疫苗通過誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8⁺T細胞，為克服ICB耐藥提供了有前景的策略。腺相關(guān)病毒（AAV）載體因其良好的安全性和可工程化特性，在疫苗遞送領(lǐng)域備受關(guān)注。AAV6血清型能直接靶向抗原呈遞細胞（APCs），增強抗原呈遞。然而，基于AAV的疫苗面臨預(yù)存免疫和疫苗誘導(dǎo)的載體特異性免疫（如中和抗體）的限制。新抗原（neoAg）疫苗能激發(fā)特異性T細胞反應(yīng)，并與ICB產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究在前期開發(fā)的工程化AAV2新抗原疫苗（AAVax）基礎(chǔ)上，深入探討其與放療、ICB聯(lián)用的療效，并創(chuàng)新性地提出AAV2/AAV6異源初免-加強策略以突破免疫限制。

在MSS-CRC（CT26）和TNBC（4T1）小鼠模型中，評估了AAVax聯(lián)合局部放療（8 Gy × 3）和抗PD-1抗體的療效。在CT26模型中，AAVax單獨給藥可輕微延緩腫瘤生長，但與放療聯(lián)用（AAVax/RT）或三者聯(lián)用（AAVax/RT/抗PD-1）能顯著縮小腫瘤體積，并分別達到33.33%和66.67%的完全緩解（CR）率。腫瘤組織分析顯示，聯(lián)合治療組中腫瘤浸潤CD3⁺、顆粒酶B（GzmB）⁺T細胞以及GzmB⁺CD8⁺T細胞密度顯著增加。在4T1模型中觀察到類似結(jié)果，聯(lián)合療法增強了ICB反應(yīng)和T細胞浸潤。更重要的是，AAVax/RT/抗PD-1聯(lián)合治療顯著降低了自發(fā)肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生風險，表明其能有效抑制遠處轉(zhuǎn)移。

在ASB-XIV小鼠肺癌模型中，通過全外顯子組測序（WES）和RNA測序（RNA-seq）篩選出9個潛在新抗原，構(gòu)建了AAVax-ASB疫苗。治療結(jié)果顯示，AAVax-ASB顯著延緩腫瘤生長，與放療聯(lián)用可誘導(dǎo)16.67%的CR率，而三聯(lián)療法（AAVax-ASB/RT/抗PD-1）將CR率提升至約66.67%。流式細胞術(shù)分析表明，三聯(lián)療法顯著增加了腫瘤內(nèi)CD4⁺和CD8⁺T淋巴細胞（TILs）的浸潤，并擴增了效應(yīng)記憶CD4⁺和CD8⁺T細胞亞群。同時，細胞毒性IFNγ⁺CD8⁺T細胞、CD3⁺、GzmB⁺及GzmB⁺CD8⁺T細胞頻率均顯著升高。此外，聯(lián)合治療組中CD8⁺TILs上的耗竭標志物PD-1表達顯著降低。這些結(jié)果表明AAVax-ASB疫苗能有效觸發(fā)T細胞反應(yīng)，增強肺癌對ICB的敏感性。

為克服AAV2載體特異性免疫（如中和抗體）的限制，研究優(yōu)化了AAV6載體。構(gòu)建了包括S663V、T492V/S663V以及T492V/S663V/I585-RGD（優(yōu)化AAV6， oAAV6）在內(nèi)的多種修飾AAV6衣殼。體外實驗顯示，三重修飾的oAAV6在樹突狀細胞（DCs）中具有更優(yōu)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并能顯著上調(diào)DCs成熟標志物CD80和CD86。在肺癌模型中，比較了同源（AAV2/AAV2）與異源（AAV2/AAV6， AAV2/oAAV6）初免-加強策略。AAV2/oAAV6異源疫苗接種顯示出更強的腫瘤消退效果，并顯著增加了腫瘤內(nèi)CD11c⁺DCs和CD3⁺T細胞的浸潤。流式分析進一步證實，AAV2/oAAV6組中腫瘤內(nèi)CD8⁺TILs、效應(yīng)記憶CD8⁺T細胞（T_EM）以及細胞毒性標志物GzmB和IFNγ陽性的CD8⁺T細胞頻率均顯著升高。T細胞受體（TCR）測序分析顯示，異源接種后TCR多樣性降低，優(yōu)勢克隆富集，表明產(chǎn)生了聚焦的新抗原特異性T細胞反應(yīng)。ELISPOT實驗證實，針對特異性新抗原肽（如mPhf3和mGlud1）的T細胞反應(yīng)增強。重要的是，異源AAV2/oAAV6策略顯著降低了血清中抗AAV2中和抗體的水平，成功規(guī)避了同源接種引發(fā)的載體免疫限制。

在雙側(cè)荷瘤（ASB-XIV）小鼠模型中，評估異源接種聯(lián)合放療能否引發(fā)系統(tǒng)性（遠隔）抗腫瘤效應(yīng)。對一側(cè)（原發(fā)）腫瘤進行局部放療，并給予AAV2初免和AAV6或oAAV6加強。結(jié)果顯示，AAV2/oAAV6聯(lián)合放療組在原發(fā)腫瘤中實現(xiàn)了約66.7%的CR率，顯著高于AAV2/AAV6聯(lián)合放療組（33.3%）。尤為關(guān)鍵的是，未經(jīng)照射的對側(cè)（遠隔）腫瘤體積也顯著縮小。機制上，聯(lián)合治療顯著增加了腫瘤內(nèi)CD11c⁺DCs和CD3⁺T細胞的浸潤，并提升了成熟CD86^Hi和CD80^HiDCs的頻率。轉(zhuǎn)錄組分析和流式細胞術(shù)證實，NK細胞和T細胞顯著富集，且細胞毒性IFNγ⁺CD8⁺和GzmB⁺CD8⁺TILs數(shù)量增加。來自聯(lián)合治療組小鼠的脾臟T細胞在體外對ASB-XIV癌細胞表現(xiàn)出更強的殺傷能力。這些結(jié)果證明，AAV2/oAAV6異源疫苗接種聯(lián)合放療能重塑腫瘤微環(huán)境，激發(fā)強大的系統(tǒng)性T細胞免疫，從而有效清除遠處腫瘤細胞。

癌癥疫苗是誘導(dǎo)新抗原特異性T細胞免疫的有效手段。本研究證實，工程化AAV2新抗原疫苗平臺與放療及ICB聯(lián)用，能有效克服弱免疫原性腫瘤的ICB耐藥，重塑腫瘤微環(huán)境。研究的主要創(chuàng)新在于提出了AAV2/優(yōu)化AAV6（oAAV6）的異源初免-加強免疫策略。oAAV6通過衣殼修飾（T492V/S663V/I585-RGD）增強了DC靶向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。該策略不僅放大了新抗原特異性CD8⁺T細胞反應(yīng)，還成功規(guī)避了因預(yù)存或治療誘導(dǎo)的抗AAV2中和抗體所導(dǎo)致的疫苗效力衰減問題。這與近年來其他利用腺病毒、李斯特菌等平臺的異源接種研究結(jié)論一致，均顯示出優(yōu)于同源策略的免疫效果。然而，新抗原特異性T細胞本身往往不足以完全清除腫瘤。本研究突出表明，AAV2/oAAV6疫苗接種與放療聯(lián)用產(chǎn)生了強大的協(xié)同效應(yīng)，顯著增加了細胞毒性IFNγ⁺CD8⁺和GzmB⁺CD8⁺T細胞，這對于克服免疫抑制性腫瘤微環(huán)境、清除遠處未照射的腫瘤細胞至關(guān)重要。

研究使用6周齡雌性BALB/c小鼠。細胞系包括CT26、4T1、ASB-XIV和293T等，均按標準方法培養(yǎng)并檢測支原體。AAV載體通過三重轉(zhuǎn)染293T細胞制備并純化，滴度通過qPCR測定。通過WES和RNA-seq篩選ASB-XIV的新抗原，并使用NetMHCpan算法預(yù)測MHC-I結(jié)合肽。體外通過LPS刺激RAW264.7細胞或使用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)骨髓細胞來獲得樹突狀細胞。體內(nèi)腫瘤實驗在小鼠皮下接種腫瘤細胞后進行，當腫瘤體積達到約70-100 mm³時開始治療。治療方案包括肌肉注射AAV疫苗（1×10⁸vg/劑）、局部放療（8 Gy × 3）和腹腔注射抗PD-1抗體（100 μg/鼠）。腫瘤體積定期測量，終點時收集組織進行流式細胞術(shù)、免疫熒光、TCR測序、ELISPOT等分析。所有動物實驗均遵循相關(guān)倫理指南。