艱難梭菌（Clostridioides difficile）是引起醫院獲得性腹瀉和偽膜性結腸炎的重要病原菌。傳統上，其致病機制主要聚焦于其產生的兩種主要毒素TcdA和TcdB。然而，毒素水平本身無法完全解釋不同菌株間顯著的毒力差異，表明除毒素外，菌株特異的生物學特性、代謝能力、孢子形成、粘附/定植能力以及與宿主微生物組的相互作用等，可能也是決定毒力變異的關鍵因素。

近年研究表明，艱難梭菌在腸道生態位中獲取營養物質的能力、代謝適應性及底物利用譜，直接影響其定植成功、孢子萌發、毒素表達以及與宿主/微生物群的競爭優勢。特別是，該菌能夠發酵支鏈氨基酸并利用中央碳代謝的替代途徑（如丙酮酸和乙酰輔酶A），從而在抗生素破壞微生物群后的腸道生態系統中獲得代謝優勢。同時，來自宿主或共生菌的代謝底物（如膽汁酸、糖醇、粘蛋白降解產物）已被證明是艱難梭菌定植和增殖的關鍵營養來源，表明其代謝適應與宿主-微生物群相互作用密切相關。近期研究表明，有毒力與無毒力菌株之間存在顯著的代謝差異：高毒力菌株可能激活氨基酸發酵途徑、有機酸產生途徑甚至脂質代謝重塑，而非毒力菌株可能在代謝活性或底物利用上存在局限。

盡管如此，對于不同毒力艱難梭菌菌株在純培養條件下的代謝組學變化研究仍然缺乏，特別是從非靶向代謝組學的角度，系統闡明菌株間底物利用譜、代謝物積累及其與毒力表達的相關性尚待深入。因此，本研究旨在利用非靶向代謝組學方法比較不同核糖體型/序列型臨床分離株的代謝產物。研究選擇了四個核糖體型/序列型譜系，因為它們代表了臨床上和流行病學上已確立的毒力梯度，從高毒力的RT027/ST1譜系到相對低毒力的RT012/ST54譜系，RT046/ST35和RT017/ST37則處于中間位置。

本研究使用的艱難梭菌菌株來自先前獲得的臨床分離株庫。該菌株庫最初來源于2016年3月至2017年4月在淄博市中心醫院和青島大學附屬醫院進行的一項多中心流行病學研究，共收集了504份非重復性CDI（艱難梭菌感染）患者糞便樣本。基于此庫，篩選出代表四個主要核糖體型/序列型譜系（RT027/ST1、RT046/ST35、RT017/ST37和RT012/ST54）的分離株用于當前的代謝組學實驗。

糞便樣本接種于ChromID艱難梭菌瓊脂平板，并在37°C厭氧條件下孵育48小時。典型的艱難梭菌菌落隨后使用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）和VITEK MS系統進行鑒定。

多位點序列分型（MLST）使用七個基因位點進行。PCR產物純化后在北京泰和生物技術公司進行測序。將DNA序列與PubMLST數據庫進行比對以獲得等位基因編號、序列型（ST）和進化枝。PCR核糖體分型通過毛細管凝膠電泳進行。使用Gene Marker V2.2.0確定每個峰的大小，并通過WEBRIBO數據庫呈現數據并分配核糖體型。

對四種艱難梭菌菌株的細菌細胞進行代謝組學分析，采用液相色譜-質譜聯用技術。經過48小時厭氧生長后，離心收集細菌沉淀以提取代謝物。

細菌沉淀在4°C短暫解凍，加入200μL預冷的超純水和800μL預冷的甲醇進行提取。樣品充分渦旋，并在冰浴中進行超聲破碎20分鐘。通過-20°C孵育1小時實現蛋白質沉淀，隨后在4°C、16000g條件下離心20分鐘。收集上清液用于代謝物分析。

剩余的蛋白質沉淀風干后，用200μL SDT裂解緩沖液重懸，并使用BCA法測定細菌總生物量。根據蛋白質含量，將等體積的含代謝物上清液真空濃縮干燥。在進行LC-MS分析前，將干燥的提取物用40μL甲醇-水溶液重懸，并在4°C、20000g條件下離心20分鐘。最終的上清液用于后續LC-MS進樣分析。

在代謝組學分析中，每個序列型作為一個獨立的臨床分離株進行分析，并設有生物學重復。LC-MS分析對每個分離株獨立進行。為了進行多元分析，使用MetaboAnalyst 6.0對歸一化峰強度矩陣進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。使用Spearman相關分析篩選在預定義毒力梯度（ST54-ST35/ST37-ST1）中表達存在差異的代謝物，并通過倍數變化進行過濾。

相關性系數ρ > 0.6且P > 0.05的代謝物被視為與毒力增加或減少顯著相關。在必要時應用Benjamini–Hochberg校正進行錯誤發現率（FDR）校正以控制多重檢驗。對于兩兩比較，使用單因素方差分析和事后檢驗評估統計學顯著性。數據以均值±標準差表示。

代謝組學檢測平臺使用島津Nexera X2超高效液相色譜系統與AB Sciex Triple TOF 6600高分辨質譜儀聯用。色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC^?HSS T3柱。質譜分析在正離子模式下進行，掃描范圍設置為m/z 50–1,000。MS/MS譜圖使用數據依賴性采集模式獲取。

原始質譜數據使用MS-DIAL軟件進行峰提取、保留時間校正和峰面積歸一化。基于MS/MS碎片信息進行代謝物鑒定，并參考HMDB、KEGG和MassBank等公共數據庫進行比較和篩選。為確保數據質量，在整個過程中加入空白對照和混合QC樣本，用于質量控制和儀器穩定性監測。

使用單因素方差分析結合事后多重比較檢驗來鑒定菌株間的差異代謝物。P值使用Benjamini–Hochberg錯誤發現率進行校正。FDR校正后P < 0.05的代謝物被認為具有統計學顯著性。

本研究采用LC-MS非靶向代謝組學技術分析了四種艱難梭菌菌株的代謝物。質量控制驗證顯示QC樣本在正/負離子模式下具有高度一致性，表明儀器性能穩定。多元統計分析揭示了四種菌株間代謝物譜的顯著差異。在正離子模式下，PCA得分圖顯示四組間存在清晰的分離趨勢，主成分1和主成分2分別貢獻了31.20%和14.97%的方差。這種自然聚類趨勢在監督性的PLS-DA模型中得到了進一步驗證和強化，顯示出優異的組間分離，表明菌株具有獨特的代謝表型特征。在負離子模式下，PCA和PLS-DA模型同樣顯示出顯著的組間分離趨勢。這一趨勢與正離子模式分析結果一致，證實了不同核糖體型和序列型的艱難梭菌菌株在其內在代謝物組成上存在根本性差異。總之，質量控制系統表現出優異的穩定性，多元統計模型清晰地揭示了ST1、ST35、ST37和ST54菌株代謝譜的整體差異，表明本研究獲得的代謝組學數據可靠，適用于后續差異代謝物篩選和通路分析。

本研究在非靶向代謝組學分析中共鑒定出3,255種代謝物，其中正離子模式檢測到1,735種，負離子模式檢測到1,520種。在正離子模式下，羧酸及其衍生物以及異戊二烯類化合物占比最高，其次是類固醇衍生物及其類似物。在負離子模式下，類固醇及其衍生物構成最大類別，其次是羧酸及其衍生物。KEGG代謝通路富集分析（TOP30）顯示，正離子模式結果突出了脂質代謝和細胞膜重塑，而負離子模式則強調了碳水化合物攝取和細胞壁碳水化合物代謝。這些通路將在討論部分結合毒力相關的代謝重編程進行解讀。

火山圖和熱圖直觀展示了正負離子模式下不同菌株間的差異代謝物。

差異代謝物篩選結果顯示，在ST1與ST54的正離子模式比較中，鑒定出70個顯著差異代謝物，包括16個上調和54個下調的代謝物。比較ST1與ST35揭示了45個差異代謝物：33個上調和12個下調。比較ST1與ST37鑒定出66個差異代謝物：23個上調和43個下調。在負離子模式下，同樣觀察到顯著的組間差異，其中ST1與ST54之間檢測到的差異最豐富，揭示了73種差異代謝化合物（13個上調和60個下調）。

差異代謝物的代謝通路富集分析顯示，正離子模式主要突出了脂質代謝和細胞膜結構重塑，表明膜結構和信號傳導可能是毒力差異的關鍵因素。負離子模式則強調了碳水化合物攝取和利用以及細胞壁碳水化合物代謝，表明不同血清型在能量代謝和細胞壁結構組裝方面存在顯著差異。煙酸和煙酰胺代謝通路的共同富集表明，能量代謝重編程可能是維持不同毒力水平的基礎。

基于已發表的流行病學數據、實驗感染模型以及原始患者分離株的臨床嚴重程度評分，將四種菌株歸入預定義的毒力等級：ST1為高毒力譜系，ST35和ST37為中等毒力譜系，ST54為低毒力譜系。所有提及“毒力增加”的分析均遵循此特定排序：ST54→ST35/ST37→ST1。

利用四種處于既定毒力梯度內的艱難梭菌菌株的非靶向代謝組學數據，確定了正負離子模式下隨著毒力增加而逐步上調和下調的代謝物。值得注意的是，代謝物的變化在所有菌株中并非均質，而是與其相對毒力水平呈單調模式。例如，有機酸、類固醇、三萜類以及能量相關代謝物隨著從低毒力ST54到中等毒力ST35和ST37，再到高毒力ST1的過程而逐漸增加。這一趨勢表明，與能量代謝、膜脂質代謝和應激防御相關的通路激活程度隨著菌株毒力增加而上調，這可能為高毒力菌株提供了更高的生物合成能力和環境適應性。

相反，包括核苷及其衍生物、細胞壁前體、膽汁酸代謝物和各種生物堿在內的48種代謝物，從ST54到ST1呈階梯式下降。這種沿毒力梯度的協調性下調可能反映了高毒力菌株中細胞壁生物合成和核苷酸代謝受到抑制，表明代謝資源被重新分配以支持快速生長、毒素產生和應激抵抗。

通過整合Metaboanalyst 6.0和KEGG等數據庫，我們進一步篩選出13個與CDI毒力梯度相關且生物學意義最高的潛在生物標志物。其中上調的包括：異芒果苷、人參皂苷Ro、甘氨膽酸、乳酸、5-氨基戊酸、異戊酸、異丁酸和α-氨基丁酸；下調的化合物包括：肌苷、甘氨熊去氧膽酸、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰葡糖胺和膽固醇。這些毒力相關趨勢在菌株間的變化已可視化。

根據MetaboAnalyst 6.0數據庫，上述13個差異表達代謝物主要富集在以下通路：初級膽汁酸生物合成、丙酮酸代謝、糖酵解或糖異生、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、類固醇生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝以及類固醇激素生物合成。

我們檢測到隨著菌株毒力增加，甘氨膽酸顯著上調，而甘氨熊去氧膽酸下調，這表明毒力菌株間膽汁酸組成的差異可能與孢子萌發和致病潛力密切相關。先前研究表明，初級膽汁酸如牛磺膽酸鹽和膽酸鹽可顯著誘導艱難梭菌孢子萌發，而某些次級膽汁酸或結合形式如鵝去氧膽酸鹽則是有效的競爭性抑制劑，可抑制牛磺膽酸鹽誘導的萌發并降低菌株的毒力表達。其他研究也表明，不同菌株對次級膽汁酸的敏感性不同，這些差異與菌株毒力和腸道定植能力相關。因此，我們假設在高毒力菌株中，對初級膽汁酸的生物合成或耐受機制增強，而次級或結合膽汁酸的產生或作用減弱。這種膽汁酸重塑可能使這些菌株在宿主體內孢子萌發和早期增殖階段獲得優勢。

本研究中，隨著菌株毒力增加，包括乳酸、異戊酸、異丁酸和α-氨基丁酸在內的發酵代謝物持續上調。這表明這些菌株可能加速或增強氨基酸發酵和短鏈/支鏈脂肪酸的產生，以滿足其高代謝需求和毒素合成要求。先前文獻表明，外源性短鏈脂肪酸（SCFAs）如丁酸鹽在環境中抑制艱難梭菌生長，同時促進孢子形成和毒素釋放，顯示了SCFAs在調節菌株存活和毒力方面的雙重作用。同時，綜述表明SCFA水平和腸道代謝環境的改變通常與CDI嚴重程度呈負相關。高濃度SCFA可能抑制菌株增殖，但可能驅動毒力基因表達以對抗競爭壓力。基于我們的發現，此類發酵產物的上調可能不僅反映了在資源有限或競爭條件下代謝資源的重新分配，還可能觸發了與毒力相關的調節通路。

我們的結果表明高毒力菌株中膜脂相關代謝活性增強，同時細胞壁前體如N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺下調。這表明膜結構合成和細胞壁合成之間可能存在代謝權衡。近期一項研究發現，關鍵糖脂的合成酶UgtA和UgtB主導了艱難梭菌的膜脂組成。約50%的膜極性脂質是糖脂，這一比例遠高于許多其他細菌，表明膜脂結構對艱難梭菌的生存和致病性具有特殊重要性。細胞壁前體合成途徑在細菌生長、形態維持和宿主免疫逃避中起著關鍵作用。先前研究表明，當細胞壁合成被抑制或資源被轉移到其他代謝或毒力相關過程時，細菌細胞壁完整性和分泌系統功能可能受損。根據我們觀察到的下調趨勢，我們假設高毒力菌株可能抑制或稀釋細胞壁合成途徑中的中間產物，同時重新配置膜脂以優化分泌系統或膜蛋白定位，從而促進毒素分泌、粘附或免疫逃避。

NAD⁺是多種脫氫酶和氧化還原反應的關鍵輔酶。其可用性影響細菌在氧化代謝和發酵之間的代謝途徑選擇，直接影響生物能量學、應激反應和次級代謝能力。在艱難梭菌中，氧化還原調節蛋白及相關代謝途徑已被證明與NAD⁺再生、發酵代謝和毒素產生相關聯。因此，煙酸/煙酰胺代謝的改變為理解高毒力菌株如何在代謝水平上調控毒力提供了合理的分子機制。

本研究確定的13種代謝物涉及膽汁酸、短鏈和支鏈脂肪酸、膜脂和細胞壁前體等多種通路。它們沿毒力梯度的一致變化表明這些代謝物有潛力作為艱難梭菌毒力分型的標志物。膽汁酸代謝與艱難梭菌孢子萌發和生長密切相關。初級膽汁酸如牛磺膽酸鹽誘導萌發，而次級膽汁酸如脫氧膽酸鹽和石膽酸鹽則具有抑制作用。短鏈脂肪酸（SCFAs）如丁酸鹽和異戊酸不僅影響能量代謝，還調節毒素表達和孢子形成。此外，細胞膜脂質組成和細胞壁前體代謝的改變可影響膜蛋白定位、分泌系統效率和對宿主防御的耐受性，從而改變毒力水平。這些發現表明，毒力增加可能伴隨著能量分配和膜結構重塑的重編程。未來的研究可以通過靶向LC-MS/MS定量、動物模型和臨床樣本驗證這些代謝物的診斷價值，同時利用ROC曲線和機器學習模型評估其分型或預測能力。

除了膽汁酸和能量代謝外，半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及類固醇生物合成也在通路富集分析中被確定為與毒力相關的代謝程序。半胱氨酸和蛋氨酸代謝是氧化還原穩態、甲基轉移和依賴硫的酶功能的關鍵，這對厭氧細菌的發育和應激耐受機制極為重要。硫氨基酸代謝通量的增強可能有助于谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸和其他輔因子的產生，從而提高對氧化應激的耐受性并調節毒力基因表達。

類固醇生物合成是一種宿主相關通路，與腸道中細菌對甾醇和膽汁酸衍生物的底物改變和利用密切相關。宿主酶將膽固醇衍生的類固醇合成膽汁酸，然后通過細菌代謝過程進行改變。因此，高毒力菌株中類固醇相關代謝物的生物合成增強與膽汁酸池的重塑一致，也可能有助于增加初級膽汁酸衍生物的可用性，從而促進孢子萌發和生長。這種代謝聯系為本研究中發現的類固醇相關代謝物與毒力相關的膽汁酸標志物之間提供了機制上的聯系。

RT027/ST1屬于進化枝2，被廣泛認為是高毒力譜系。它反復與毒素A和B產量增加、二元毒素CDT的存在、孢子形成增強以及CDI患者復發率、并發癥發生率和死亡率升高相關。臨床隊列研究和實驗感染模型均表明，與大多數其他譜系相比，ST1菌株表現出更優越的定植、持久性和致病性。

相比之下，RT012/ST54通常被認為是低毒力譜系。ST54的臨床分離株與較輕的疾病、較低的毒素活性和宿主組織中較弱的炎癥反應相關，并且經常從病情較輕的CDI患者中分離到。

RT046/ST35和RT017/ST37代表中等毒力譜系。這些菌株通常在臨床隊列中表現出中等的毒素產量、孢子形成能力和疾病嚴重程度，處于ST1和ST54所代表的極端情況之間。在本研究所用菌株最初分離的中國山東省的流行病學研究中，ST35和ST37與中等臨床嚴重程度評分相關，而ST1顯示出最高的嚴重程度，ST54則最低。

因此，本研究中分析的四種菌株代表了一個在生物學和臨床上已驗證的毒力梯度（ST1 > ST35 ≈ ST37 > ST54），而非隨意排序。本文鑒定的代謝組學差異因此可以解釋為這些已確立的菌株特異性毒力表型的分子相關性。

本研究的主要目的是在受控和標準化的條件下，描述具有不同毒力背景的艱難梭菌分離株內在的、菌株特異的代謝多樣性。因此，我們有意選擇體外代謝組學平臺，以減少宿主因素的影響，并允許更直接地比較細菌的代謝表型。

盡管體外培養條件允許控制菌株和生長環境，但這同時也意味著缺乏宿主因素以及腸道內實際膽汁酸池和營養競爭環境的復雜性。此外，宿主和微生物群產生的膽汁鹽水解酶（BSHs）和其他膽汁酸修飾酶可能在體內顯著塑造膽汁酸譜，