《Frontiers in Immunology》：A 7-gene expression signature predicts immune microenvironment remodeling and neoadjuvant chemo-immunotherapy response in lung squamous cell carcinoma
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本文聚焦于肺鱗狀細胞癌（LUSC）新輔助化療免疫治療（NCI）中的耐藥難題。研究通過RNA測序（RNA-seq）分析治療前后樣本，揭示NCI能促使治療反應(yīng)良好（MPR）患者的腫瘤免疫微環(huán)境（TME）從“冷”轉(zhuǎn)為“熱”表型。研究者篩選出一個由HOXC13等7個基因組成的表達特征，與不良治療反應(yīng)相關(guān)，并在外部數(shù)據(jù)集中驗證了其預(yù)測價值，為LUSC患者分層和克服免疫治療耐藥提供了新的潛在生物標志物與策略。
引言
肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，肺鱗狀細胞癌（LUSC）是其第二常見亞型，約占總數(shù)的20%至30%。對于可切除的晚期LUSC，手術(shù)仍是治療基石，但其可切除率較低且術(shù)后易復(fù)發(fā)。鑒于LUSC中可靶向的致癌突變較少，新輔助化療免疫療法（NCI）已成為主要的術(shù)前治療策略。盡管NCI改善了患者預(yù)后，但部分患者仍然耐藥，其機制尚不清楚。免疫治療主要靶向免疫微環(huán)境而非腫瘤細胞本身，旨在逆轉(zhuǎn)免疫抑制的微環(huán)境。本研究旨在通過分析NCI治療前后成對腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組變化，探索與治療反應(yīng)相關(guān)的免疫微環(huán)境重塑和預(yù)測生物標志物。
方法
研究連續(xù)納入了2020年至2022年間在上海肺科醫(yī)院接受NCI治療的40例IIB-IIIC期LUSC患者。所有患者在接受2-4個周期的PD-1抗體聯(lián)合化療后接受手術(shù)。根據(jù)術(shù)后病理評估，將患者分為主要病理緩解（MPR）組（30例，75%）和非MPR組（10例，25%）。收集治療前（活檢）和治療后（手術(shù)切除）的配對腫瘤樣本，進行批量RNA測序（RNA-seq）。通過CIBERSORT算法和基于單細胞研究衍生的134種免疫細胞類型標記物進行免疫細胞富集分析。使用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）識別與“冷”和“熱”腫瘤表型相關(guān)的基因模塊。生存分析使用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗，并在OAK臨床試驗數(shù)據(jù)集中進行外部驗證。
結(jié)果：NCI后MPR患者免疫浸潤顯著增加
轉(zhuǎn)錄組測序和信號通路富集分析顯示，在MPR組患者中，NCI治療后與免疫應(yīng)答和抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)的多種通路（如異體移植排斥、補體系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)等）顯著上調(diào)。相反，在非MPR組中，治療后上調(diào)的通路較少，主要涉及肌生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凝血途徑等。進一步分析134種免疫細胞亞型的富集評分發(fā)現(xiàn)，在MPR組中，多種免疫細胞相關(guān)特征（如未成熟B細胞、活化B細胞、效應(yīng)記憶CD8+T細胞、自然殺傷T細胞等）在NCI后顯著增加；而在非MPR組中，未觀察到顯著的免疫細胞富集變化。治療后，MPR腫瘤顯示出比非MPR腫瘤更高的抗腫瘤免疫活性。這些結(jié)果表明，NCI在應(yīng)答者中引發(fā)了強有力的適應(yīng)性免疫激活，而在無應(yīng)答者中，免疫重塑則受到抑制。
基于免疫微環(huán)境聚類識別與治療反應(yīng)相關(guān)的“熱”和“冷”腫瘤
通過對治療前后樣本的RNA-seq和免疫微環(huán)境聚類分析，可以將樣本區(qū)分為“冷”和“熱”表型。治療后，根據(jù)腫瘤免疫微環(huán)境（TME）特征，可將樣本分為四個亞群。其中，簇1（C1）和簇2（C2）因T細胞和NK細胞富集評分較高而被歸類為“熱”腫瘤；簇3（C3）和簇4（C4）因B細胞和樹突狀細胞富集評分較低而被定義為“冷”腫瘤。桑基圖分析顯示，近一半的“冷”腫瘤在NCI后轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤。治療后，96.4%的MPR患者處于“熱”腫瘤簇，而75%的非MPR患者仍停留在“冷”腫瘤簇，強調(diào)了“熱”表型與良好治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。
鑒定與NCI療效相關(guān)的7個基因
為探索與NCI療效相關(guān)的基因，研究者比較了從“熱”轉(zhuǎn)為“冷”（HC）和保持“冷”（CC）狀態(tài)的腫瘤之間的差異表達基因（DEGs），并結(jié)合WGCNA模塊分析和單因素邏輯回歸。最終，三個數(shù)據(jù)集的交集確定了7個與NCI療效相關(guān)的基因：TNNT1、FOXL2、LMX1B、NEFL、HOXC13、ASS1和KLK11。這7個基因在非MPR組中的表達顯著高于MPR組。以這7個基因的平均表達建立的模型，在預(yù)測非MPR狀態(tài)時顯示出良好的診斷效能（AUC = 0.837）。相關(guān)性分析顯示，這些基因的表達與多種免疫細胞類型的動態(tài)變化存在顯著關(guān)聯(lián)，例如HOXC13與大多數(shù)免疫細胞的富集變化呈負相關(guān)。
在公共數(shù)據(jù)庫驗證7個基因表達水平與免疫治療效果的相關(guān)性
在包含10例可切除II-III期LUSC患者的獨立新輔助隊列中，基于7個基因高表達定義的高風險組MPR率遠低于低風險組。進一步，利用III期OAK臨床試驗數(shù)據(jù)的驗證發(fā)現(xiàn)，在LUSC免疫治療組中，高基因表達的患者比低基因表達患者具有更短的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）。然而，在LUSC化療組中，這7個基因的表達并不影響患者的OS和PFS。這表明這7個基因的表達與免疫治療效果相關(guān)，高表達可能降低療效，且可能作為LUSC特異性免疫治療生物標志物。其中，HOXC13與OS顯著相關(guān)，并與PFS有相關(guān)趨勢。
討論與結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)，在MPR患者中，NCI治療能將腫瘤免疫微環(huán)境從“冷”表型重塑為“熱”表型，顯著增加抗腫瘤免疫細胞的浸潤。而在非MPR患者中，這種免疫重塑則不明顯。通過整合分析，研究篩選出一個由7個基因（TNNT1、FOXL2、LMX1B、NEFL、HOXC13、ASS1和KLK11）組成的表達特征，該特征與不良的NCI反應(yīng)相關(guān)，并在外部數(shù)據(jù)集中驗證了其預(yù)測價值。其中，HOXC13被證實與免疫細胞浸潤減少和較差的免疫治療效果相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為理解LUSC的NCI耐藥機制提供了新見解，并提示該7基因特征和HOXC13等關(guān)鍵因子有潛力作為預(yù)測LUSC患者NCI療效的生物標志物，為臨床克服免疫治療耐藥提供了潛在策略。
