《Frontiers in Immunology》：Ziyuglycoside II ameliorates chemotherapy-induced neutropenia by promoting neutrophil differentiation and functional recovery via SPI1 and C/EBP? transcriptional regulation
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本文研究表明，來源于中藥地榆（Sanguisorba officinalis）的生物活性成分Ziyuglycoside II (ZGSII)，通過靶向轉錄因子SPI1和C/EBP?，有效促進中性粒細胞分化、成熟并恢復其吞噬和ROS生成等功能，顯著改善了環磷酰胺（CY）誘導的中性粒細胞減少癥（CIN）模型小鼠的骨髓抑制和生存率。其作用機制不同于傳統G-CSF療法，為CIN的臨床治療提供了新的潛在治療策略。
3.1 ZGSII可減輕環磷酰胺誘導的中性粒細胞減少癥和骨髓抑制
為評估ZGSII對化療所致中性粒細胞減少癥（CIN）的治療效果，研究人員建立環磷酰胺（CY）誘導的小鼠CIN模型，并分別給予ZGSII（12 mg/kg/天，5天）或陽性對照藥物重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF，40 μg/kg/天，4天）。血細胞計數分析顯示，CY給藥后第2天和第4天，白細胞、中性粒細胞等顯著減少，成功誘導了白細胞減少癥和中性粒細胞減少癥模型。G-CSF治療從第4天起顯著升高白細胞和中性粒細胞計數，而ZGSII誘導了更漸進性的恢復，到第6天時，與CY模型組相比，白細胞和中性粒細胞計數分別升高了1.6倍和1.7倍。此外，ZGSII還促進了單核細胞計數的逐漸恢復，但對淋巴細胞或紅細胞水平影響不顯著。組織學分析表明，ZGSII和G-CSF均能顯著改善骨髓組織細胞構成。與G-CSF引起明顯脾腫大不同，ZGSII對胸腺和脾臟指數無顯著影響，提示其安全性更好。
3.2 ZGSII促進中性粒細胞重建而不引起過度骨髓動員
為探究ZGSII對中性粒細胞發育的影響，研究人員利用流式細胞術分析了小鼠骨髓中中性粒細胞亞群的變化。結果顯示，CY處理在誘導后兩天內顯著降低了不成熟中性粒細胞的比例，同時增加了成熟中性粒細胞的比例，提示CY誘導的骨髓抑制可能同時刺激了緊急粒細胞生成。從第2天到第4天，G-CSF顯著擴增了不成熟中性粒細胞池，而ZGSII誘導的反應則更為溫和。到第6天，ZGSII和G-CSF處理組的總體中性粒細胞水平均超過了基線值。值得注意的是，CY處理小鼠的不成熟中性粒細胞比例維持在較高水平，而G-CSF在增加成熟中性粒細胞方面比ZGSII更有效。然而，中性粒細胞成熟指數分析顯示，ZGSII處理在Day 6時將該比率恢復到接近正常水平，而G-CSF則恢復到高于正常水平。這表明，雖然兩種藥物都能促進中性粒細胞生成，但G-CSF可能導致過度骨髓動員，而ZGSII支持了更平衡的重建，未過度消耗造血儲備。
3.3 ZGSII通過恢復轉錄程序促進中性粒細胞成熟以逆轉CIN
為進一步闡明ZGSII促進中性粒細胞分化和改善CIN的機制，研究人員在第4天和第6天對小鼠骨髓樣本進行了RNA測序。比較分析發現了大量的差異表達基因。對骨髓微環境中免疫細胞浸潤的分析表明，CY處理在第4天導致了骨髓中性粒細胞的顯著耗竭，而ZGSII治療逆轉了這一現象。時序聚類分析進一步顯示，ZGSII顯著逆轉了CY誘導的轉錄改變。基因本體論（GO）富集分析表明，這些基因在白細胞遷移、髓系白細胞活化、炎癥反應調節等生物過程高度富集。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析則揭示了與白細胞跨內皮遷移、細胞因子-細胞因子受體相互作用、造血細胞譜系等通路顯著相關。
3.4 ZGSII通過上調關鍵發育基因促進晚期中性粒細胞分化和活化
為描繪ZGSII調控的中性粒細胞發育階段，研究人員分析了公共數據集GSE137539，重點關注正常小鼠樣本的中性粒細胞相關群體。通過整合中性粒細胞亞群與先前定義的差異表達基因，研究人員確定了37個關鍵基因。這些基因在ZGSII處理后上調，并且在具有更高分化和成熟度評分的G3至G5亞群中富集。GO富集分析顯示，這些關鍵基因在髓系白細胞遷移、白細胞趨化性、中性粒細胞活化等生物過程中顯著富集。
3.5 ZGSII通過轉錄調節因子SPI1和C/EBP?促進粒細胞分化和成熟
為闡明ZGSII緩解CIN的分子機制，研究人員基于37個關鍵基因構建了蛋白質-蛋白質互作網絡，發現了多個樞紐基因，如Ltf、Lcn2、Cxcr2、Mmp8/9和S100a8/9。RT-qPCR驗證了包括Ltf、Cxcr2在內的部分基因mRNA表達水平，蛋白質印跡分析進一步證實了LTF和CXCR2的蛋白表達。結果顯示，ZGSII處理在轉錄和翻譯水平上逆轉了LTF和CXCR2的失調。轉錄因子分析顯示，SPI1和C/EBP?被確定為最核心的調控因子。這些結果表明，ZGSII很可能通過調節SPI1和C/EBP?的活性來促進中性粒細胞的發育和成熟。
3.6 計算模擬揭示ZGSII與SPI1和C/EBP?的結合模式和親和力
為進一步闡明ZGSII的作用機制，研究人員進行了分子對接和分子動力學模擬。對接結果顯示，ZGSII對SPI1和C/EBP?都具有高結合親和力，結合自由能分別為-7.073 kcal/mol和-7.235 kcal/mol。分子動力學模擬評估了復合物的動力學行為。結果表明，C/EBP?-ZGSII復合物表現出構象可塑性和適應性結合特性，而SPI1-ZGSII復合物則顯示出剛性結合模式。分子力學廣義玻恩表面積法計算得到C/EBP?-ZGSII復合物和SPI1-ZGSII復合物的結合自由能分別為-29.94 ± 5.40 kcal/mol和-14.12 ± 1.16 kcal/mol，表明兩者均存在強結合相互作用，且ZGSII對C/EBP?的親和力更高。蛋白質水平驗證顯示，與對照組相比，CY模型組中SPI1和C/EBP?的表達顯著降低，而ZGSII干預有效上調了這兩種轉錄因子的蛋白表達水平。
3.7 ZGSII誘導NB4細胞分化并抑制其增殖
研究人員利用人早幼粒白血病NB4細胞系評估了ZGSII的作用。CCK-8檢測顯示，ZGSII以劑量和時間依賴性的方式抑制細胞生長。在誘導分化濃度下處理120小時后，流式細胞術分析未發現細胞周期分布或凋亡率發生顯著改變。然而，流式細胞術和Wright-Giemsa染色均證實了ZGSII能誘導濃度依賴性的分化，并伴有特征性的形態學成熟。這表明ZGSII對NB4細胞的生長抑制與髓系分化特異性相關，而非普遍的細胞增殖抑制。
3.8 ZGSII有效增強中性粒細胞功能并賦予CIN小鼠生存優勢
此外，酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測了血清中細胞因子GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平。結果顯示，CY處理顯著降低了血清GM-CSF水平，同時顯著增加了促炎細胞因子IL-6和TNF-α的水平。這些改變均被G-CSF或ZGSII給藥顯著逆轉。功能評估表明，ZGSII處理增強了中性粒細胞效應功能：與CY對照組相比，其吞噬能力接近正常水平，而活性氧（ROS）的生成則通過硝基藍四氮唑（NBT）還原實驗測量增加了1.8倍。這些功能的恢復與CIN小鼠在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）攻擊下的生存率改善相關。在高劑量和低劑量細菌感染模型中，ZGSII處理均顯著延長了小鼠的生存期，證實了所觀察到的血液學恢復具有功能性意義。
4 討論
本研究證明，ZGSII能有效對抗CIN，并通過轉錄調控關鍵的造血程序促進中性粒細胞重建，同時恢復中性粒細胞功能并提高菌血癥宿主的生存率，從而維持骨髓穩態。ZGSII顯著補充了外周中性粒細胞群，并減輕了環磷酰胺誘導的中性粒細胞減少癥模型中的骨髓組織細胞減少。值得注意的是，ZGSII增強了中性粒細胞恢復，而未誘導過度骨髓動員，這意味著它平衡地恢復了造血功能，避免了與G-CSF治療相關的快速祖細胞耗竭風險。RNA-seq分析表明，ZGSII給藥與CY誘導的轉錄改變顯著逆轉相關，特別是在與白細胞遷移、髓系細胞活化和炎癥反應調節相關的通路基因中。該研究鑒定了37個相關基因，并揭示了以Ltf、Cxcr2、Mmp8/9和S100a8/9等為核心的功能網絡。機制觀察表明，ZGSII通過調節關鍵轉錄調節因子介導中性粒細胞分化。計算對接和分子動力學模擬提示，ZGSII可能通過激活SPI1驅動造血干細胞向髓系分化，并通過誘導C/EBP?激活促進粒細胞成熟。經ZGSII處理的NB4細胞表現出與髓系分化特異性相關的生長抑制。ZGSII恢復了中性粒細胞的吞噬能力，并通過NBT還原實驗增強了ROS的生成，這表明其功能恢復超越了單純的數值恢復。這些細胞和分子的改善轉化為CIN小鼠在感染金黃色葡萄球菌后的顯著生存獲益。與傳統的G-CSF等生長因子療法相比，ZGSII似乎具有獨特的治療優勢，后者主要刺激細胞增殖。雖然G-CSF加速中性粒細胞增殖，但ZGSII通過轉錄調控增強了定向分化和功能成熟。此外，其細胞因子調節作用可能有助于減輕與化療相關的炎癥并發癥。本研究也存在一些局限性，例如長期毒性、藥代動力學/藥效學研究以及與聚乙二醇化G-CSF的比較需要進一步研究；研究主要依賴于NB4細胞系，其可能無法完全概括正常造血祖細胞的生物學特性；未來需要使用遺傳學或藥理學方法抑制SPI1和C/EBP?來確立其因果關系。
5 結論
總之，本研究結果表明，ZGSII通過轉錄調控SPI1和C/EBP?，顯著改善化療誘導的中性粒細胞減少癥，促進中性粒細胞重建。這些發現為ZGSII作為一種減輕化療所致血液學毒性且不影響治療效果的潛在治療劑提供了臨床前證據。
