以抗PD-1為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）已徹底改變了晚期黑色素瘤的治療格局，但其所引發(fā)的免疫相關(guān)不良事件（irAEs）已成為影響患者治療與生活質(zhì)量的重要臨床挑戰(zhàn)。irAEs的病理生理機(jī)制尚不完全清楚，尤其在肢端型黑色素瘤這一亞型中。針對(duì)irAEs的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物仍很缺乏。外周血單核細(xì)胞（PBMCs）作為系統(tǒng)性免疫反應(yīng)的微創(chuàng)監(jiān)測(cè)窗口，是探索與療效和毒性相關(guān)循環(huán)標(biāo)志物的寶貴資源。本研究旨在利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）技術(shù)，全面刻畫接受抗PD-1單藥（主要為特瑞普利單抗，toripalimab）治療的肢端型黑色素瘤患者中，與irAEs發(fā)生相關(guān)的免疫特征。

本研究納入了八名黑色素瘤患者：三名在ICI治療后發(fā)生irAEs（AE組），三名治療后未發(fā)生irAEs（NAE組），以及兩名未接受治療的對(duì)照患者（UNT組）。觀察到的具體irAEs包括惡心、嘔吐、疲勞（使用帕博利珠單抗pembrolizumab后）、皮疹和白癜風(fēng)（使用特瑞普利單抗后）以及紅斑性丘疹（使用特瑞普利單抗后）。NAE組患者均接受特瑞普利單抗治療。

對(duì)總計(jì)54，793個(gè)高質(zhì)量PBMCs進(jìn)行單細(xì)胞分析。與NAE組和UNT組相比，AE組CD4⁺T細(xì)胞頻率降低，而CD8⁺T細(xì)胞頻率增加。NAE組則表現(xiàn)出更高的NK細(xì)胞頻率和更低的單核細(xì)胞頻率。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至總T細(xì)胞后，AE組的CD8⁺T細(xì)胞頻率最高，CD4⁺T細(xì)胞頻率最低。與治療前相比，治療后（AE和NAE組）T細(xì)胞中PDCD1（PD-1）表達(dá)降低，而CTLA4， TIGIT， LAG3， HAVCR2（TIM-3）及轉(zhuǎn)錄因子TOX表達(dá)增加，且這些效應(yīng)在AE組中更為明顯。總之，抗PD-1治療與PBMC內(nèi)T細(xì)胞亞群平衡的改變相關(guān)，表現(xiàn)為CD8⁺T細(xì)胞增加和CD4⁺T細(xì)胞減少，這一轉(zhuǎn)變?cè)贏E組最為顯著。

對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行亞分析，鑒定出11個(gè)不同的亞群：三個(gè)CD4⁺T細(xì)胞亞群、三個(gè)CD8⁺T細(xì)胞亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、γδ T細(xì)胞（gdT）、黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（MAIT）、增殖性T細(xì)胞及其他未指定T細(xì)胞。通過(guò)經(jīng)典標(biāo)志物，將CD8 T_2定義為過(guò)渡性/效應(yīng)記憶樣CD8⁺T細(xì)胞（表達(dá)GZMK），CD8 T_3定義為終末效應(yīng)/細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞（表達(dá)CX3CR1， GZMB等）。分析顯示，AE組處于G2/M期的細(xì)胞比例略高，增殖性T細(xì)胞的頻率也較NAE組增加。與治療前和NAE組相比，抗PD-1治療后AE組中CD8 T_3（細(xì)胞毒性）細(xì)胞的頻率增加，而CD8 T_2細(xì)胞的頻率降低。CD8 T_2與CD8 T_3細(xì)胞的比率在AE組中相比UNT組大幅下降。這些結(jié)果表明，T細(xì)胞向細(xì)胞毒性和增殖性表型增強(qiáng)的傾向與AE組患者發(fā)生irAEs存在機(jī)制上的聯(lián)系。

差異表達(dá)基因和基因集變異分析（GSVA）表明，CD8 T_3（細(xì)胞毒性）簇富含GNLY， FGFBP2， GZMB， NKG7等細(xì)胞毒性標(biāo)志物，其細(xì)胞毒性評(píng)分也最高。CD8 T_2（過(guò)渡性）簇以GZMK， CCL4， CCL5為標(biāo)志，其GZMK⁺過(guò)渡性基因特征評(píng)分最高，而細(xì)胞毒性評(píng)分較低。抗PD-1治療增強(qiáng)了細(xì)胞毒性和耗竭相關(guān)通路的表達(dá)，同時(shí)降低了與GZMK⁺過(guò)渡性基因、幼稚細(xì)胞標(biāo)志物和高PD-1表達(dá)相關(guān)的通路表達(dá)。患者年齡與GZMK表達(dá)或GSVA評(píng)分無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。基因本體（GO）分析進(jìn)一步揭示，CD8 T_2簇在T細(xì)胞活化和分化相關(guān)通路中富集，而CD8 T_3簇主要在細(xì)胞毒性相關(guān)通路中富集。

對(duì)CD8⁺T細(xì)胞的進(jìn)一步分析將其分為幼稚、過(guò)渡性（GZMK⁺）、細(xì)胞毒性1、細(xì)胞毒性2和增殖性五個(gè)簇。小提琴圖顯示，過(guò)渡性（GZMK⁺）簇代表了一個(gè)中間狀態(tài)，表現(xiàn)出中等的幼稚和細(xì)胞毒性特征評(píng)分，而其GZMK過(guò)渡性特征評(píng)分達(dá)到峰值。抗PD-1治療后，AE組的細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞顯著增加，而幼稚和過(guò)渡性（GZMK⁺）細(xì)胞相應(yīng)減少。此外，過(guò)渡性與細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比率在AE組相比UNT組顯著降低。相反，NAE組的幼稚CD8⁺T細(xì)胞比例略高，細(xì)胞毒性細(xì)胞比例與UNT組相當(dāng)。AE組還表現(xiàn)出相比NAE和UNT組更高的增殖能力。GO分析顯示，AE組在細(xì)胞殺傷相關(guān)通路中特異性富集，而UNT和NAE組則更多與代謝和細(xì)胞活化通路相關(guān)。總之，這些結(jié)果進(jìn)一步表明，抗PD-1治療后，AE組細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞顯著增加，并伴有過(guò)渡性與細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞比率降低。

軌跡分析揭示了CD8⁺T細(xì)胞從幼稚狀態(tài)出發(fā)的兩條主要分化路徑：一條導(dǎo)向過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞，另一條導(dǎo)向終末細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞。過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞主要位于該軌跡的中點(diǎn)，表明其是在完全分化為細(xì)胞毒性表型之前的關(guān)鍵過(guò)渡階段。隨著偽時(shí)間（pseudotime）的推移，幼稚和細(xì)胞毒性標(biāo)志物在軌跡兩端分別達(dá)到峰值，而GZMK， CMC1和DUSP2等標(biāo)志物則在過(guò)渡階段達(dá)到峰值，提示細(xì)胞功能的逐步轉(zhuǎn)變。分支表達(dá)分析建模（BEAM）顯示，向細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞分化的軌跡特征在于NKG7， GZMB， GNLY， PRF1等細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性相關(guān)基因的富集；而向過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞分化的軌跡則與MALAT1， NEAT1， GZMK等基因的富集相關(guān)，暗示其為功能轉(zhuǎn)換準(zhǔn)備的細(xì)胞狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)表明，過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞可能作為一種多功能的中介，在抗PD-1治療后調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，影響受控免疫反應(yīng)與攻擊性細(xì)胞毒性攻擊之間的平衡。

本研究通過(guò)對(duì)接受抗PD-1治療的肢端型黑色素瘤患者的PBMCs進(jìn)行scRNA-seq分析，揭示了與irAEs相關(guān)的獨(dú)特免疫特征。與文獻(xiàn)一致，研究發(fā)現(xiàn)AE組患者總CD4⁺T細(xì)胞減少，總CD8⁺T細(xì)胞和單核細(xì)胞增加。深入分析顯示，AE組患者表現(xiàn)出細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞增加、GZMK⁺過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞減少以及增殖性細(xì)胞升高。本研究并未發(fā)現(xiàn)先前報(bào)道的irAEs患者中MAIT和Tregs減少的現(xiàn)象。高表達(dá)GZMB， PRF1， GNLY的細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞具有強(qiáng)大的效應(yīng)功能，這可能有利于強(qiáng)效抗腫瘤活性，但也可能暗示其導(dǎo)致脫靶組織損傷從而引發(fā)irAEs的傾向。標(biāo)記有GZMK表達(dá)的過(guò)渡性CD8⁺T細(xì)胞，似乎代表了從幼稚狀態(tài)到完全細(xì)胞毒性狀態(tài)之間的中間階段。這些細(xì)胞富集GZMK⁺過(guò)渡性標(biāo)志物，其細(xì)胞毒性GSVA評(píng)分較低，表明其細(xì)胞毒性能力更為克制。這種克制可能有助于緩和激進(jìn)的免疫反應(yīng)，從而在有效腫瘤控制和減輕治療相關(guān)毒性之間取得平衡。它們?cè)贏E患者中的耗竭可能破壞這種平衡，有利于不受控制的細(xì)胞毒性活動(dòng)和組織損傷。軌跡分析證實(shí)，GZMK⁺T細(xì)胞位于幼稚到細(xì)胞毒性分化連續(xù)體的過(guò)渡狀態(tài)。這突顯了過(guò)渡性與細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞比率作為irAE風(fēng)險(xiǎn)的探索性候選生物標(biāo)志物的潛力。此外，AE組患者增殖性T細(xì)胞比例增加，可能放大了具有更高反應(yīng)性的克隆，這與irAEs發(fā)生率增加相符。本研究也存在局限性，例如樣本量較小。未來(lái)工作應(yīng)通過(guò)TCR克隆性測(cè)定和抗原特異性篩選來(lái)確定irAEs中的細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞是自身反應(yīng)性的還是腫瘤特異性的。同時(shí)，探索GZMK在過(guò)渡性細(xì)胞功能中作用的機(jī)制研究，可能為解耦療效與毒性提供新的治療靶點(diǎn)。

總而言之，本研究強(qiáng)調(diào)了在最大化ICIs治療效果的同時(shí)最小化其不良反應(yīng)所需的微妙平衡。通過(guò)闡明細(xì)胞毒性、過(guò)渡性和增殖性CD8⁺T細(xì)胞在irAE發(fā)生中的作用，為理解肢端型黑色素瘤患者抗PD-1治療期間的免疫失調(diào)提供了新的見解。描繪這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變及其功能后果，使我們更接近預(yù)測(cè)、預(yù)防和管理黑色素瘤患者irAEs的個(gè)體化策略。