《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification of the EXO70 genes to elucidate their potential roles for intraspecific cross-incompatibility in sweet potato (Ipomoea batatas L.)
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這篇研究首次在甘薯（Ipomoea batatas L.）中系統鑒定了EXO70基因家族，揭示其進化保守性與表達特異性，并鎖定候選基因IbEXO70-26（屬EXO70H亞組）在調控種內雜交不親和性（ICI）中的關鍵作用，為深入解析甘薯花粉-柱頭互作的分子機制提供了重要線索。
1 引言
甘薯（Ipomoea batatas L.）作為全球七大糧食作物之一，具有高產、適應性強和營養豐富等特點。然而，在育種過程中，種內雜交不親和性（ICI）頻繁發生，成為限制親本組合和育種進展的主要瓶頸。甘薯已根據ICI劃分為16個不親和群（A至O及X），同一群內品種間雜交不親和，不同群間則兼容。ICI的表現型為不親和組合中花粉無法在柱頭上萌發，這與孢子體自交不親和（SSI）的表現型相似，其特征是柱頭胼胝質積累。
在十字花科（Brassicaceae）中，SSI的調控機制已較為明確，涉及SCR（S位點半胱氨酸豐富蛋白）與SRK（S位點受體激酶）的識別，并通過下游ARC1（Arm重復包含蛋白1）介導EXO70的泛素化降解，從而破壞分泌囊泡運輸，抑制花粉水合與花粉管萌發。EXO70作為外囊復合體的關鍵亞基，在囊泡運輸和胞吐作用中扮演核心角色，在真核生物中高度保守。在陸地植物中，EXO70基因家族經歷了顯著擴張，分為三個主要分支（EXO70.1、EXO70.2、EXO70.3）和九個亞組（EXO70A-I），參與多種生長發育過程。例如，在擬南芥中，EXO70A1是SSI系統中的關鍵兼容性決定因子；EXO70A2的破壞會降低花粉萌發效率；EXO70C2則是花粉管頂端生長的主要調節因子。
然而，在甘薯中，對EXO70基因的研究仍很有限。前期轉錄組分析發現，多個EXO70基因在雜交親和與不親和樣本中存在差異表達，提示該家族成員可能參與甘薯種內雜交不親和性的調控。因此，本研究旨在：（1）全面鑒定甘薯基因組中的EXO70家族基因；（2）系統分析其結構特征與表達模式，以篩選參與ICI調控的候選基因。
2 材料與方法
本研究使用了三個甘薯品種：‘廣薯79’（GS79）、‘廣薯146’（GS149）和‘商薯19’（SS19）。其中，GS146（母本）與GS79（父本）構成雜交親和組合，GS146（母本）與SS19（父本）構成雜交不親和組合。
利用HMMER軟件和EXO70的隱馬爾可夫模型（PF03081）從甘薯‘臺中6號’基因組中鑒定候選EXO70基因，并通過CDD數據庫確認保守結構域，最終獲得IbEXO70家族成員。同時，從二倍體近緣種Ipomoea trifida和Ipomoea triloba基因組中鑒定同源基因。利用MEGA軟件進行多序列比對并構建系統發育樹（鄰接法，Poisson校正模型，1000次自舉重復）。
通過ExPASy ProtParam分析蛋白質理化性質；使用WoLF PSORT預測亞細胞定位；利用TBtools進行染色體分布、基因結構（外顯子-內含子）可視化及保守基序分析；使用PlantCARE對啟動子區（轉錄起始位點上游2000 bp）的順式作用元件進行預測。
采用MCScanX分析基因復制事件（串聯復制和片段復制），并利用TBtools進行共線性分析。
通過qRT-PCR（實時定量PCR）分析35個IbEXO70基因在16種不同組織（包括花瓣、花蕾期、芽期、花托、柱頭、花粉、親和授粉柱頭、不親和授粉柱頭、功能葉、新展葉、葉柄和莖等）中的表達譜。
將IbEXO70-26的全長編碼序列克隆至pCAMBIA1300-GFP載體，通過農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導的瞬時轉化在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中表達，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP融合蛋白的亞細胞定位。
3 結果
3.1 EXO70基因家族在Ipomoea物種中的鑒定、染色體定位與特征
在三個Ipomoea物種中共鑒定到94個EXO70基因：六倍體甘薯（I. batatas）35個，二倍體近緣種I. trifida 30個和I. triloba 29個。這表明EXO70基因家族在Ipomoea中高度保守，多倍化后未發生大規模基因擴張。
染色體分布分析顯示，基因分布不均勻。在二倍體物種I. trifida和I. triloba中，EXO70基因主要集中在2、4、5和7號染色體上，分布模式高度相似。而在六倍體甘薯中，IbEXO70基因分布在除3號染色體外的所有15條染色體上，主要集中在1、2、12、13和14號染色體上，這暗示了多倍體進化過程中可能存在染色體重排或功能特化。
根據染色體位置，基因被命名為IbEXO70-1至35、ItfEXO70-1至30和ItbEXO70-1至29。理化性質分析顯示，IbEXO70蛋白長度在406（IbEXO70-1）至1163（IbEXO70-17）個氨基酸之間，分子量45.32至128.65 kDa，等電點（pI）4.74至9.16。亞細胞定位預測表明，大多數IbEXO70蛋白定位于葉綠體和細胞質，僅IbEXO70-14和IbEXO70-32預測定位于細胞核。
3.2 不同物種EXO70基因的系統發育分析
利用I. batatas、I. trifida、I. triloba、擬南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）的EXO70蛋白序列構建系統發育樹。所有基因被分為三個主要分支：EXO70.1、EXO70.2和EXO70.3，并可進一步劃分為九個亞組（EXO70A-I）。其中，EXO70.1分支僅包含EXO70A亞組（29個基因，占18.35%）；EXO70.2分支包含六個亞組（EXO70B-F和H，97個基因，占61.40%）；EXO70.3分支包含EXO70G和I兩個亞組（32個基因，占20.25%）。
EXO70H亞組基因數量最多，表明其在雙子葉植物中經歷了快速擴張，其次是EXO70A，而EXO70F成員最少。亞組分布在Ipomoea物種間高度保守，特別是在EXO70B-F亞組中，基因數量幾乎相同。相比之下，單子葉植物水稻在EXO70I亞組中含有更多基因，且該亞組在雙子葉植物中缺失，這揭示了EXO70基因在單雙子葉植物間的差異。
3.3 Ipomoea物種EXO70基因的結構分析
基于進化關系，對EXO70家族成員的保守蛋白基序和基因結構進行了系統分析。共鑒定出10個保守基序，廣泛分布于三個物種的EXO70蛋白中。所有成員均包含保守的EXO70結構域。
外顯子/內含子組織分析揭示了顯著的結構多樣性。外顯子和內含子數量相對較高的基因主要聚集在EXO70A亞組。例如，IbEXO70-15包含13個外顯子，ItfEXO70-14和ItbEXO70-15各包含12個外顯子。相比之下，其他亞組的EXO70基因通常只包含1到3個外顯子。同一亞組內的基因也表現出明顯的結構變異，例如在EXO70H亞組中，IbEXO70-17包含8個外顯子，而ItfEXO70-10和ItbEXO70-11僅包含1個外顯子。這表明同一亞組內的EXO70基因在結構上存在相當大分歧，可能反映了功能分化或譜系特異性進化適應。
3.4 I. batatas EXO70基因的順式作用元件分析
對35個IbEXO70基因轉錄起始位點上游2 kb的啟動子區進行了順式作用元件分析。共鑒定出30種順式調控元件，可分為五大類：激素響應元件、光響應元件、植物生長發育相關元件、非生物與生物脅迫響應元件以及轉錄因子結合位點。
激素響應元件是最豐富的類別，包括九種類型：ABRE（脫落酸響應）、AuxRR-core（生長素響應）、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應）、GARE-motif、P-box、TATC-box（赤霉素響應）和TCA-element（水楊酸響應）。除IbEXO70-6外，所有IbEXO70基因的啟動子區都至少含有一個植物激素響應元件。其中，參與脫落酸信號轉導的ABRE元件最為普遍，提示IbEXO70基因可能在脫落酸介導的調控通路中發揮作用。
此外，還檢測到多個光響應元件（如ACE、G-box、GT1-motif等），表明IbEXO70基因可能參與光調控的生物學過程。啟動子區還含有與脅迫響應相關的元件（如ARE、LTR、TC-rich repeats等），以及轉錄因子結合位點（如MBS、MBSI等）。這些結果表明，IbEXO70基因可能受到多種環境和發育信號的調控，并參與廣泛的生物過程。
3.5 I. batatas中EXO70基因的共線性分析
共線性分析發現了串聯復制和片段復制事件。檢測到兩個串聯復制對：IbEXO70-19/IbEXO70-20和IbEXO70-32/IbEXO70-33。同時鑒定出八個片段復制對，例如IbEXO70-31/IbEXO70-18、IbEXO70-13/IbEXO70-16等。這些結果表明，片段復制是驅動甘薯EXO70基因家族進化的主要機制，而串聯復制的作用相對較小。
多物種比較共線性分析顯示，Ipomoea屬內基因組保守性很高。在I. batatas與I. trifida之間鑒定出46個直系同源EXO70基因對，與I. triloba之間鑒定出40對。相比之下，與較遠緣物種的同源基因對數量減少：與雙子葉植物擬南芥有22對，與單子葉植物水稻僅有8對。這表明甘薯EXO70基因家族與雙子葉物種具有更高的進化保守性。分析表明，甘薯EXO70基因的擴張和多樣化可能發生在與單子葉植物分化之后、但在Ipomoea屬內物種形成之前。
3.6 IbEXO70家族基因的組織特異性表達動態
通過qRT-PCR檢測了35個IbEXO70家族成員在甘薯不同組織中的表達模式。總體上，大多數基因在花蕾期、芽期、開花植株葉柄、非開花植株莖和葉柄中表達水平較低。相比之下，在其余被檢組織中，至少有一個IbEXO70基因表達上調。值得注意的是，在花粉中檢測到7個基因表達峰值，在親和授粉柱頭（GS 146 × GS 79）中檢測到8個，在不親和授粉柱頭（GS 146 × SS 19）中檢測到9個。這些組織特異性和授粉特異性表達模式表明，IbEXO70基因積極參與生殖過程，特別是在花粉功能和授粉期間的柱頭響應中，并可能在調控甘薯花粉-柱頭互作中發揮重要作用。
為深入探究IbEXO70基因在甘薯ICI調控中的作用，我們聚焦于在親和授粉柱頭中相較于不親和或未授粉柱頭顯著上調表達的基因。根據qRT-PCR結果，鑒定出八個候選基因：IbEXO70-7、IbEXO70-13、IbEXO70-24、IbEXO70-26、IbEXO70-27、IbEXO70-28、IbEXO70-30和IbEXO70-34。其中，IbEXO70-13、IbEXO70-30和IbEXO70-34在所有16種組織中普遍表達，暗示其具有更廣泛的細胞功能。相比之下，IbEXO70-26和IbEXO70-27表達水平最高，并表現出顯著的組織特異性，主要在授粉后柱頭、未授粉柱頭、花粉和花托組織中優勢表達，而在其他組織中表達極低。這種獨特的表達模式表明，IbEXO70-26和IbEXO70-27可能在生殖發育和花粉-柱頭互作中扮演特化角色，是參與甘薯ICI的強候選基因。
前期轉錄組分析曾鑒定出六個在ICI中差異表達的IbEXO70基因：IbEXO70-4、IbEXO70-12、IbEXO70-15、IbEXO70-16、IbEXO70-17和IbEXO70-26。其中，IbEXO70-26是唯一一個在MFT（親和授粉柱頭）與FT（不親和授粉柱頭）比較組中顯示出顯著表達差異的基因，而在FT vs CK（未授粉柱頭）和MT（經雜交不親和克服試劑處理的柱頭）vs CK中未檢測到顯著差異。這種獨特的表達模式進一步支持IbEXO70-26是調控甘薯種內雜交不親和性的關鍵候選基因。
3.7 IbEXO70-26的亞細胞定位
為了探究IbEXO70-26的潛在功能，將其全長編碼序列與綠色熒光蛋白（GFP）融合，進行亞細胞定位分析。自由GFP對照的熒光信號出現在細胞質、細胞膜和細胞核中。相比之下，IbEXO70-26-GFP融合蛋白的熒光信號僅存在于細胞核中，這表明IbEXO70-26主要定位于細胞核。這一發現與大多數EXO70家族成員定位于細胞質和細胞膜的經典模式不同，但與EXO70H在煙草和擬南芥中定位于細胞核的報道一致。
4 討論與結論
本研究基于基因數量、染色體分布、結構特征和分類，探究了甘薯EXO70基因家族的進化關系。在三個Ipomoea物種中鑒定到94個EXO70基因，六倍體甘薯與二倍體近緣種之間基因數量相近，表明EXO70家族基因在Ipomoea物種間高度保守。這與棉花和小麥中EXO70基因數量隨基因組多倍化而增加的情況不同，可能歸因于六倍體甘薯六套基因組間的高同源性以及多倍化過程中未發生基因復制。然而，EXO70基因的染色體分布存在明顯差異，這可能是多倍體進化過程中染色體重排、片段復制和基因易位的結果，并可能導致不同的生物學功能。這些發現支持甘薯是自體六倍體或異源六倍體物種的假說。
系統發育分析將Ipomoea物種的EXO70基因分為三個主要分支和九個亞組，與其他植物的研究一致。EXO70A-H亞組的基因分布和結構構建在栽培甘薯與其野生近緣種之間高度相似，進一步證明了EXO70基因在Ipomoea中的保守性。與擬南芥、棉花、黃瓜等相比，Ipomoea物種中的EXO70A亞組有效擴增，尤其是IbEXO70A亞組擁有10個基因。與其它植物物種類似，EXO70A亞組成員持續含有更多的外顯子。共線性分析揭示，串聯復制和片段復制共同促進了IbEXO70基因家族的進化，其中片段復制是主要機制。值得注意的是，片段復制對中有三對來自IbEXO70A亞組。由于EXO70A參與典型的外囊功能，在極性胞吐、極性生長和細胞壁生物合成中至關重要，這暗示IbEXO70A基因可能在甘薯發育和生長中扮演重要角色。
啟動子分析為IbEXO70基因的調控潛力提供了見解。鑒定出大量與植物激素信號相關的順式作用元件，特別是與ABA信號和非生物脅迫響應相關的ABRE元件。此外，也識別出光響應和脅迫響應元件。這些發現表明，IbEXO70基因受到多種環境和發育信號的調控，可能參與包括脅迫適應和生殖發育在內的多個生物過程。
跨組織表達譜分析顯示，數個IbEXO70基因在生殖器官，特別是花粉和柱頭中優先表達。重要的是，九個IbEXO70基因在親和與不親和授粉柱頭之間表現出顯著的差異表達。其中，IbEXO70-26在親和柱頭中表現出特異且高水平的表達，而在其他組織中表達水平低。轉錄組差異分析進一步證實，IbEXO70-26是唯一在MFT和FT比較組中顯示顯著表達差異的EXO70基因。這種獨特的表達模式強烈提示IbEXO70-26在調控甘薯種內雜交不親和性中具有特異性作用。
在十字花科中，EXO70A1已被確定為兼容性因子，其功能喪失突變會破壞花粉水合并抑制花粉管伸長。然而，IbEXO70-26屬于EXO70H亞組，并在親和柱頭中相較于屬于EXO70A亞組的IbEXO70-7和IbEXO70-34表現出顯著的表達差異。擬南芥中EXO70H的功能研究表明，EXO70H1參與病原體響應；EXO70H3、EXO70H5、EXO70H6在花粉中高表達；而EXO70H4在胼胝質合酶分泌中具有特異性作用。柱頭乳突細胞中胼胝質沉積已被證明是抑制花粉萌發和觸發甘薯ICI的關鍵因素。此外，IbEXO70-26基因含有MYB轉錄因子結合位點，而MYB轉錄因子對于正常花粉萌發和結實至關重要。這些觀察共同表明，作為EXO70H亞組成員，IbEXO70-26可能通過調節花粉-柱頭識別信號并影響親和授粉期間的花粉管生長，作為一種替代的兼容性響應因子發揮作用。
先前研究大多表明EXO70蛋白主要定位于細胞質和細胞膜，在胞吐作用、囊泡運輸和極性生長中發揮作用，這些過程與自交不親和反應中的花粉水合和花粉管發育密切相關。然而在本研究中，IbEXO70-26特異定位于細胞核，這與大多數EXO70家族成員的經典定位模式顯著不同。這與EXO70H在煙草和擬南芥中定位于細胞核的報道一致。推測IbEXO70-26基因在調控甘薯ICI中發揮非典型的分泌功能，而是在信號轉導和轉錄調控中發揮作用，從而影響下游兼容或不兼容基因的表達。
綜上所述，本研究全面分析了甘薯EXO70基因家族的進化特征、結構特點、表達模式及潛在功能。我們的結果將IbEXO70-26鑒定為參與調控甘薯種內雜交不親和性的強候選基因。盡管需要進一步的功能驗證，但本工作為未來研究，包括IbEXO70-26的遺傳轉化和分子解析，以闡明其在甘薯生殖兼容性中的確切作用奠定了堅實的基礎。
