《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification, classification, and expression pattern analysis of the TCP transcription factor family in carrot
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胡蘿卜（Daucus carota L.）是重要的傘形科根莖類蔬菜。本研究通過生物信息學方法，首次在胡蘿卜全基因組范圍系統鑒定出50個TCP基因家族成員（DcTCPs），并對其理化性質、進化關系、表達模式及調控網絡進行了深入分析。研究發現，DcTCPs主要定位于細胞核，結構簡單且內含子少，并富含與光、激素及逆境響應相關的順式作用元件。家族成員在胡蘿卜不同發育階段根部呈現特異性表達，部分基因（如DcTCP33和DcTCP37）在肉質根整個發育過程中持續高表達，暗示其在肉質根形成與膨大中發揮關鍵調控作用。本研究闡明了胡蘿卜TCP家族的基本特征與調控機制，為后續利用TCP基因改良胡蘿卜品質與抗逆性提供了重要理論基礎和基因資源。
引言
胡蘿卜作為一種在全球廣泛栽培的傘形科根莖類蔬菜，具有重要的營養和經濟價值，其可食用的膨大肉質根是其主要的營養貯藏器官。TCP（Teosinte branched1/Cycloidea/Proliferating cell factor）是一個植物特有的轉錄因子家族，其成員含有一個非典型的堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）結構域，在調控植物生長發育及響應逆境脅迫中扮演著至關重要的角色。然而，相較于擬南芥和水稻等模式植物，在胡蘿卜等根莖類作物中，關于TCP基因家族的系統性研究尚屬有限。因此，本研究旨在利用生物信息學手段，對胡蘿卜TCP基因家族進行全面鑒定和深入分析，以期揭示其在胡蘿卜肉質根發育及環境適應中的潛在功能，為胡蘿卜的遺傳改良提供新的基因靶點。
胡蘿卜TCP基因家族的鑒定與分類
研究團隊通過生物信息學方法，從胡蘿卜全基因組中成功鑒定出50個TCP基因家族成員，并依據它們在染色體上的位置依次命名為DcTCP1至DcTCP50。對這50個DcTCP基因編碼的蛋白質理化性質分析顯示，其氨基酸長度在55至496個之間，分子量范圍從6，056到53，512.5 Da，平均約為28，857.83 Da。理論等電點（pI）介于4.73至9.8之間。絕大多數蛋白質（90%）的不穩定指數大于40，被歸類為不穩定蛋白。所有DcTCP蛋白的親水性平均值（GRAVY）均小于0，表明它們是親水性的。亞細胞定位預測結果顯示，所有50個DcTCP家族成員均定位于細胞核。
染色體定位與共線性分析
染色體定位分析表明，這50個DcTCP基因不均勻地分布在胡蘿卜的9條染色體上。其中，1號染色體上的DcTCP基因數量最多，達到16個，而5號和9號染色體上最少，各僅有2個。家族擴張機制分析揭示了22對串聯重復基因和8對片段重復基因，且所有片段重復基因對的非同義替換率與同義替換率之比（Ka/Ks）均小于1，表明它們經歷了純化選擇。全基因組重復（WGD）是驅動胡蘿卜TCP家族擴張的主要動力。
通過比較胡蘿卜與擬南芥和水稻的TCP基因共線性關系發現，胡蘿卜與擬南芥存在29對共線性基因，而胡蘿卜與水稻之間僅發現4對共線性基因，這表明胡蘿卜TCP基因與擬南芥的同源性更高。
系統發育、基因結構與蛋白結構域分析
為了探究胡蘿卜TCP基因的系統發育關系，研究者構建了包含胡蘿卜、芹菜和擬南芥TCP蛋白序列的系統進化樹。根據序列差異，TCP基因被分為三個亞家族：PCF、CIN和CYC/TB1。其中，PCF亞家族的成員數量最多，在胡蘿卜中擁有36個成員，占家族總數的72%，CYC/TB1亞家族的成員數最少。
基因結構分析顯示，絕大多數DcTCP基因（47個）只含有一個外顯子，只有DcTCP11含有三個外顯子，DcTCP45含有兩個外顯子，且所有基因均不含內含子，這表明DcTCP基因具有相對簡單的結構。保守基序（motif）分析共鑒定出10個保守基序，其中基序1分布最廣，在除DcTCP9和DcTCP13之外的所有48個DcTCP蛋白中都存在，這與TCP結構域的序列高度相似，證實了這些基因作為TCP家族成員的身份。
啟動子順式作用元件與GO功能分析
對DcTCP基因啟動子區域（起始密碼子上游2000 bp）的分析，揭示出豐富的順式作用元件。這些元件可大致分為四類：激素響應元件（如CGTCA-motif、ABRE等）、光響應元件（如G-box、I-box等）、生長發育調控元件（如CAT-box、CCAAT-box等）以及脅迫響應元件（如LTR、MBS等）。值得注意的是，胡蘿卜PCF亞家族成員的啟動子中含有所有預測的順式作用元件類型，而CYC/TB1亞家族啟動子中則缺失了GCN4-motif等元件，這暗示PCF亞家族可能具有更廣泛的調控功能。
基因本體（GO）功能富集分析進一步明確了DcTCPs參與廣泛的生物學過程，包括調控分支結構形態發生、次生芽形成和花序發育等，其主要分子功能涉及結合活性和轉錄因子活性等。
互作網絡分析：蛋白質與miRNA調控
蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡預測顯示，胡蘿卜中28個DcTCP蛋白能夠與其他蛋白形成總計214對互作關系，其中DcTCP4、DcTCP3、DcTCP14和DcTCP10等蛋白的互作伙伴數量較多，表明它們可能通過招募或互作更多靶蛋白參與多樣的生物學調控。
在轉錄后調控層面，研究預測了12個與DcTCP基因存在靶向關系的microRNAs（miRNAs）。其中，miR319靶向的DcTCP基因數量最多，達到7個（包括DcTCP4、DcTCP5等），其次為miR172，靶向6個基因。絕大多數預測的miRNA通過切割其靶mRNA發揮作用，而miR402是唯一被預測通過抑制翻譯來發揮調控作用的miRNA。這揭示了TCP基因表達受到miRNA網絡的精細調控。
胡蘿卜根部不同發育階段的表達模式分析
通過分析胡蘿卜根部不同發育時期（30天、60天、95天）的轉錄組數據，研究者探究了DcTCP基因的表達動態。結果顯示，DcTCP基因在胡蘿卜發育階段廣泛表達，但呈現顯著差異。其中，DcTCP33、DcTCP37和DcTCP47在根部整個發育階段均保持相對較高的表達水平。而DcTCP39和DcTCP48的表達水平則在整個發育階段都較低。另一部分基因，如DcTCP4、DcTCP7、DcTCP10、DcTCP11、DcTCP15等，其表達水平隨著發育階段的推進而逐漸升高。
RT-qPCR對部分候選基因（如DcTCP4、DcTCP28等）的驗證結果與轉錄組數據一致，進一步證實了這些DcTCP基因在胡蘿卜根部發育過程中的動態表達模式，提示它們可能深度參與了肉質根的形成與發育調控。
結論與展望
本研究首次在胡蘿卜全基因組范圍內系統鑒定了50個TCP轉錄因子家族成員，并對其進行了全面的生物信息學分析。研究發現，胡蘿卜TCP家族主要由PCF亞家族主導，其成員具有結構簡單、定位于細胞核、啟動子富含多種響應元件等特點。家族擴張主要受全基因組重復事件驅動。表達譜分析揭示了DcTCP基因在胡蘿卜肉質根發育關鍵時期的特異性表達模式，其中部分基因（如DcTCP33和DcTCP37）的持續高表達，以及另一些基因（如DcTCP4和DcTCP10）的表達量隨發育進程遞增，強烈暗示了TCP轉錄因子在調控胡蘿卜肉質根細胞膨大、營養積累及形態建成中的核心作用。此外，研究還預測了復雜的miRNA調控網絡和蛋白質互作網絡，為理解TCP基因的精細調控機制提供了線索。綜上所述，本研究不僅豐富了植物TCP基因家族的研究內容，闡明了胡蘿卜TCP家族的基本特征與潛在調控機制，而且為后續深入解析胡蘿卜生長發育規律，以及培育抗逆、優質胡蘿卜新品種提供了重要的理論依據和寶貴的基因資源。
