《Plant Biotechnology Journal》：AaSIZ1-Mediated SUMOylation of AaMYB31 Positively Regulates Freezing Tolerance in Actinidia arguta
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本研究揭示了軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）響應低溫脅迫的分子新機制，即AaSIZ1-AaMYB31s-AaKCSs模塊通過促進表皮蠟質合成來增強耐凍性。研究發現低溫脅迫能顯著誘導蠟質合成基因AaKCS2/6.1等表達上調及蠟質積累。R2R3-MYB轉錄因子AaMYB31.1和AaMYB31.2被低溫激活，并直接結合AaKCS基因啟動子激活其表達，促進蠟質合成與耐凍性。進一步研究發現，SUMO E3連接酶AaSIZ1與AaMYB31s互作，介導其K76位點的SUMO化修飾，從而增強AaMYB31s蛋白穩定性，且該互作及SUMO化過程在低溫下顯著增強。過表達AaMYB31s或AaSIZ1均能提升獼猴桃蠟質含量與耐凍性。該工作首次闡明了SUMO化修飾調控蠟質合成以響應低溫脅迫的分子通路，為利用分子育種培育抗寒獼猴桃新品種提供了關鍵靶點和理論依據。
引言
獼猴桃富含維生素C，全球消費需求不斷增長，但低溫仍是制約其生產和地理分布的主要非生物脅迫因素。在獼猴桃屬中，軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）表現出顯著的耐寒性，其枝條可耐受低至-30°C的低溫，是研究植物冷適應分子機制的寶貴遺傳資源。雖然已有少數研究探索了軟棗獼猴桃的耐寒調控機制，但蠟質合成在冷脅迫下的分子調控機制仍不清楚。研究表明，表皮蠟質積累能增強植物對冷脅迫的耐受性。蠟質主要由超長鏈脂肪酸（VLCFAs）及其衍生物組成，在植物表面形成保護屏障。同時，MYB轉錄因子和SUMO化修飾也被發現在蠟質合成和冷脅迫響應中扮演重要角色。本研究旨在揭示軟棗獼猴桃中一個由SUMO E3連接酶、MYB轉錄因子和蠟質合成基因構成的調控模塊如何協同作用以應對冷凍脅迫。
2 結果
2.1 低溫脅迫誘導軟棗獼猴桃蠟質合成
對低溫處理的軟棗獼猴桃進行轉錄組分析發現，有21個單倍型中的蠟質合成相關差異表達基因，其中16個基因受低溫誘導上調。qPCR驗證表明，AaKCS1和AaKCS11.1/11.2/11.3/11.4在3小時迅速增加并達到峰值，而AaKCS6.1/6.2、AaKAS1.1/1.3、AaKCS4.2、AaKCS19和AaKCS2在12小時達到峰值。掃描電鏡（SEM）觀察發現，隨著冷脅迫時間延長，葉片表面表皮蠟晶數量顯著增加，形狀從顆粒狀逐漸變為片狀。氣相色譜-火焰離子化檢測（GC-FID）證實葉片總蠟質在48小時內迅速增加。其中，AaKCS6.1和AaKCS2的上調最為顯著。在中華獼猴桃（Actinidia chinensis）中過表達AaKCS2或AaKCS6.1，無論是在正常還是冷脅迫條件下，轉基因植株葉片的總蠟質含量和表皮蠟晶沉積均顯著高于野生型。冷凍表型分析顯示，過表達植株表現出更強的耐凍性，其離子滲漏率、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫（H2O2）含量和超氧陰離子（O2·?）含量均顯著低于野生型，而葉綠素含量則更高。這些結果表明，低溫誘導的蠟質生物合成增強了獼猴桃的耐凍性。
2.2 AaMYB31s直接激活AaKCSs的表達
從單倍型中鑒定出27個受低溫上調的MYB轉錄因子基因，其中16個先上調后下調。系統發育樹分析顯示，有4個MYB轉錄因子（AaMYB31.1, AaMYB31.2, AaMYB31.3, AaMYB31.4）與擬南芥的AtMYB31親緣關系密切。其中AaMYB31.1和AaMYB31.2在冷脅迫下的表達水平顯著高于AaMYB31.3和AaMYB31.4。亞細胞定位顯示AaMYB31.1和AaMYB31.2定位于細胞核，組織特異性表達表明它們在葉片中表達最高。雙熒光素酶報告基因（DLR）檢測、酵母單雜交（Y1H）和電泳遷移率變動分析（EMSA）均證實，AaMYB31.1和AaMYB31.2能直接結合到AaKCS2和AaKCS6.1基因的啟動子特定區域（如ProAaKCS2-P3、ProAaKCS6.1-P5），并激活其表達。
2.3 AaMYB31s通過正向調控蠟質合成增強耐凍性
在中華獼猴桃中過表達AaMYB31.1或AaMYB31.2，發現轉基因植株葉片的總蠟質含量在正常和冷脅迫條件下均高于野生型。蠟質成分分析表明，總蠟質含量的增加主要歸因于C24、C26、C28和C30脂肪酸，C28、C30和C32醛，C26、C28、C30和C32伯醇以及C29、C31和C33烷烴的增加。SEM觀察也證實轉基因植株葉片表面蠟晶沉積更多。此外，轉基因植株中下游蠟質合成基因AcKCS1.1、AcKCS6.1、AcKCS12.1和AcKCS19.1的表達均顯著上調。冷凍表型分析表明，過表達植株的耐凍性增強，體現在更低的離子滲漏率、MDA含量、H2O2和O2·?含量，以及更高的葉綠素含量。這些結果證明AaMYB31s通過促進蠟質合成來增強耐凍性。
2.4 AaMYB31s與AaSIZ1互作
利用AaMYB31.1作為誘餌進行Pull-down結合質譜（Pull-down MS）篩選，鑒定到一個可能的互作候選蛋白——SUMO E3連接酶AaSIZ1。該蛋白含有SAP結構域、PHD指和SP-RING結構域。酵母雙雜交（Y2H）實驗（使用去除自激活活性的AaSIZ1-N片段）、熒光素酶互補成像（LCI）實驗、體內免疫共沉淀（Co-IP）實驗以及體外Pull-down實驗均證實了AaMYB31.1/2與AaSIZ1之間存在相互作用。
2.5 AaSIZ1介導的AaMYB31s SUMO化增強其蛋白穩定性
體外和體內SUMO化實驗證明，AaMYB31.1和AaMYB31.2是SUMO化的底物。通過GPS-SUMO2.0軟件預測和點突變實驗驗證，發現K76是AaMYB31.1和AaMYB31.2 SUMO化的關鍵位點（K76R突變會破壞SUMO化）。進一步的實驗表明，AaSIZ1能夠介導AaMYB31s的SUMO化，并且在AaSIZ1存在時，SUMO化水平增強。雖然K76R突變不影響AaMYB31s的轉錄激活活性和亞細胞定位，但蛋白降解實驗表明，SUMO化修飾能顯著增強AaMYB31s的蛋白穩定性。在AaSIZ1存在或過表達AaSIZ1的植株蛋白提取物中，AaMYB31s蛋白的降解速度更慢，且蛋白酶體抑制劑MG132能進一步減緩降解，說明AaSIZ1介導的SUMO化通過抑制26S蛋白酶體途徑的降解來增強AaMYB31s的穩定性。
2.6 低溫脅迫增強AaMYB31s的SUMO化
在低溫（4°C）下，AaMYB31s過表達植株中AaMYB31s的SUMO化水平顯著高于常溫（22°C）。同時，低溫處理降低了AaMYB31s的多聚泛素化水平。蛋白穩定性檢測發現，低溫下AaMYB31.1-GFP和AaMYB31.2-GFP蛋白的降解速度比常溫下更慢，而K76R突變體蛋白的降解速度很快且不受溫度影響。此外，Co-IP實驗顯示，低溫增強了AaSIZ1與AaMYB31s之間的相互作用。這些結果表明，低溫通過增強AaSIZ1與AaMYB31s的互作，進而增強了AaSIZ1介導的AaMYB31s SUMO化，同時降低了其泛素化，最終提高了AaMYB31s的蛋白穩定性。
2.7 AaSIZ1通過促進蠟質合成正向調控耐凍性
在中華獼猴桃中過表達AaSIZ1，發現轉基因植株葉片的總蠟質含量和表皮蠟晶沉積在正常和冷脅迫條件下均顯著增加。蠟質組分分析顯示，總蠟質增加主要源于多種VLCFA衍生物的增加。冷凍表型分析證實，AaSIZ1-OE植株的耐凍性顯著增強。此外，與過表達野生型AaMYB31s的植株相比，過表達SUMO化缺陷突變體AaMYB31sK76R的植株，其蠟質積累和耐凍性雖有提升，但顯著弱于前者。這直接證明了AaSIZ1介導的AaMYB31s SUMO化在通過調控蠟質合成以增強耐凍性中的關鍵作用。
3 討論
本研究系統闡明了軟棗獼猴桃中一個全新的耐凍性調控模塊：AaSIZ1-AaMYB31s-AaKCSs。該模塊在低溫脅迫下被激活，AaSIZ1介導AaMYB31s的SUMO化，增強其穩定性，從而使其能更有效地激活下游蠟質合成基因AaKCSs的表達，促進蠟質積累，最終提高植株的耐凍性。這項工作首次將SUMO化修飾、MYB轉錄因子調控和蠟質生物合成通路聯系起來，揭示了植物應對低溫脅迫的一種精細轉錄后調控機制。研究發現軟棗獼猴桃相比中華獼猴桃具有更高效的蠟質合成調控系統，這可能是其具有卓越耐寒性的重要原因。該研究不僅增進了對植物冷適應機制的理解，也為通過分子育種手段（例如操縱AaSIZ1或AaMYB31s基因）培育抗寒性更強的獼猴桃乃至其他作物品種提供了重要的候選基因和理論框架。
