在生命活動(dòng)的微觀世界里，蛋白質(zhì)不僅是構(gòu)建細(xì)胞的基礎(chǔ)材料，更是執(zhí)行生命功能的“分子機(jī)器”。為了讓這些機(jī)器能夠精準(zhǔn)地響應(yīng)不同的指令、適應(yīng)多變的環(huán)境，細(xì)胞進(jìn)化出了一套精密的“分子開(kāi)關(guān)”系統(tǒng)——翻譯后修飾（Post-translational modifications, PTMs）。這就像給蛋白質(zhì)貼上各式各樣的“功能標(biāo)簽”，通過(guò)改變其活性、定位或穩(wěn)定性，從而調(diào)控幾乎所有的細(xì)胞過(guò)程。泛素（Ubiquitin）及泛素樣（Ubiquitin-like, UBL）蛋白介導(dǎo)的修飾，是其中至關(guān)重要的一類(lèi)。

在UBL家族中，泛素折疊修飾因子1（Ubiquitin-fold modifier 1, UFM1）及其介導(dǎo)的UFM化修飾，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。與泛素化類(lèi)似，UFM化也通過(guò)E1（激活酶）-E2（結(jié)合酶）-E3（連接酶）的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行：UBA5作為唯一的E1酶啟動(dòng)UFM1的活化，UFC1作為唯一的E2酶協(xié)助活化UFM1的轉(zhuǎn)移，而UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3三元復(fù)合體則作為核心的E3連接酶，負(fù)責(zé)將UFM1共價(jià)連接到靶蛋白的賴(lài)氨酸（Lys, K）殘基上。此外，UFM1從其前體形式（pro-UFM1）的成熟以及UFM1偶聯(lián)物的移除（去UFM化），均由UFM1特異性蛋白酶（UFM1-specific proteases, UFSPs）催化。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，UFM化過(guò)程的失調(diào)與多種疾病密切相關(guān)，包括癌癥、造血缺陷、骨骼發(fā)育不良和早發(fā)性腦病等。盡管UFM化在核糖體質(zhì)量控制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤抑制等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程中的作用日益受到認(rèn)可，但其功能機(jī)制的研究卻長(zhǎng)期受制于一個(gè)主要瓶頸——已知的UFM化底物蛋白數(shù)量極其有限。截至本研究前，已報(bào)道的UFM化底物不足30個(gè)，遠(yuǎn)少于泛素化或SUMO化等其他成熟的UBL修飾系統(tǒng)。這種匱乏源于兩大技術(shù)挑戰(zhàn)：一是核糖體蛋白L26（RPL26）是細(xì)胞內(nèi)最主要的UFM化底物，其與UFM1的偶聯(lián)物占據(jù)了細(xì)胞內(nèi)UFM1的絕大部分，從而在使用抗UFM1抗體檢測(cè)時(shí)會(huì)掩蓋低豐度底物的信號(hào)；二是傳統(tǒng)的UFM化檢測(cè)方法通常需要共轉(zhuǎn)染多個(gè)UFM化組件，操作繁瑣、易產(chǎn)生波動(dòng)，并且在富集UFM化肽段方面缺乏特異性。因此，深入理解UFM化的生物學(xué)功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)面臨巨大困難，目前也缺乏用于預(yù)測(cè)UFM化位點(diǎn)的計(jì)算工具。

為了突破這些限制，來(lái)自杭州師范大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Journal of Biological Chemistry》上發(fā)表了一項(xiàng)重要研究。他們旨在開(kāi)發(fā)一套系統(tǒng)性的策略，以改進(jìn)UFM化檢測(cè)方法，并實(shí)現(xiàn)底物的大規(guī)模鑒定。他們的核心目標(biāo)是建立一個(gè)更高效、特異和可靠的UFM化底物研究平臺(tái)。

研究人員運(yùn)用了多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)方法來(lái)推進(jìn)研究。首先，他們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在人類(lèi)HEK293T細(xì)胞中構(gòu)建了UFSP2單敲除（UFSP2^KO）以及UFSP1/UFSP2雙敲除（UFSP1^KO/UFSP2^KO, DKO）細(xì)胞系。其次，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，確定了E3連接酶組分UFL1和DDRGK1對(duì)于最大化UFM化效率的關(guān)鍵作用。最后，他們將優(yōu)化后的細(xì)胞系統(tǒng)與一種新開(kāi)發(fā)的、特異性識(shí)別UFM1殘留基序（K-ε-GV）的抗體相結(jié)合，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行高通量分析，實(shí)現(xiàn)了UFM化肽段的強(qiáng)力富集與鑒定。整個(gè)研究基于HEK293T這一人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞系模型展開(kāi)。

早期研究認(rèn)為UFSP2是人類(lèi)細(xì)胞中唯一負(fù)責(zé)pro-UFM1成熟和去UFM化的功能性蛋白酶。然而，本研究團(tuán)隊(duì)及其他課題組獨(dú)立證實(shí)，UFSP1同樣具有強(qiáng)大的蛋白酶活性，并參與pro-UFM1加工和從偶聯(lián)底物上移除UFM1的過(guò)程。蛋白質(zhì)UFM化的啟動(dòng)需要UFSP1和UFSP2對(duì)pro-UFM1進(jìn)行成熟化加工。因此，研究人員旨在構(gòu)建一個(gè)缺乏UFM1特異性蛋白酶的細(xì)胞系，從而完全廢除UFM化和去UFM化過(guò)程。當(dāng)外源引入具有暴露的羧基末端甘氨酸83（Gly⁸³）殘基的成熟形式UFM1（UFM1ΔC2）時(shí)，UFM化過(guò)程得以恢復(fù)，而去UFM化過(guò)程仍然存在缺陷。他們推斷這一策略可能建立一個(gè)更有效的系統(tǒng)來(lái)研究細(xì)胞中底物蛋白的UFM化。

研究團(tuán)隊(duì)首先利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在HEK293T細(xì)胞中敲除了UFSP2基因。蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）分析結(jié)果顯示，在UFSP2^KO細(xì)胞系中，蛋白質(zhì)UFM化水平顯著增加，主要檢測(cè)到UFM1偶聯(lián)的RPL26條帶。隨后，他們利用UFSP2^KOHEK293T細(xì)胞系進(jìn)一步敲除UFSP1基因，產(chǎn)生了UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，底物蛋白的UFM化被完全廢除，同時(shí)未偶聯(lián)的UFM1發(fā)生積累。此外，通過(guò)桑格（Sanger）測(cè)序證實(shí)了UFSP1和UFSP2基因中存在移碼突變。這些結(jié)果證明，成功構(gòu)建了可用于研究UFM化的兩種極端狀態(tài)（高UFM化與無(wú)UFM化）的細(xì)胞模型。

利用構(gòu)建的敲除細(xì)胞系，研究人員嘗試用他們的策略探索底物蛋白的UFM化狀態(tài)。他們參考已報(bào)道的蛋白質(zhì)修飾方法，為人類(lèi)細(xì)胞中的底物蛋白提供了優(yōu)化的UFM化檢測(cè)方案。他們選擇了三個(gè)已報(bào)道的UFM化底物——ASC1、RPL26和腫瘤抑制蛋白p53進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

使用該方案，他們分別在UFSP2^KO、UFSP1^KO/UFSP2^KO和野生型（WT）HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)了ASC1、RPL26和p53的UFM化。由于UFSP2的缺失導(dǎo)致UFM化蛋白的劇烈積累，他們觀察到在UFSP2^KO細(xì)胞中，外源轉(zhuǎn)染的三個(gè)底物的UFM化水平高于WT細(xì)胞。令人欣喜的是，與UFSP2^KO細(xì)胞的結(jié)果相比，在UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞中，這些底物的UFM化狀態(tài)信號(hào)更佳，包括更強(qiáng)的UFM1偶聯(lián)條帶和更明顯的多聚UFM1偶聯(lián)物。此外，他們觀察到外源FLAG標(biāo)簽底物在UFSP2^KO細(xì)胞中的蛋白水平低于其他兩組，這可能是由于UFSP2^KO細(xì)胞中持續(xù)的高水平UFM化狀態(tài)所致。相比之下，UFSP1^KO/UFSP2^KO和WT細(xì)胞之間外源FLAG標(biāo)簽底物的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果證實(shí)了該策略的可行性，并且UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞更有利于蛋白質(zhì)UFM化研究。通過(guò)將UFM1ΔC2和底物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到缺乏UFM1特異性蛋白酶的UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞中，可以實(shí)現(xiàn)更高的UFM化水平。

先前報(bào)道的UFM化蛋白質(zhì)修飾方法傾向于共轉(zhuǎn)染底物質(zhì)粒與多個(gè)UFM化組件。為了確定在UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞中進(jìn)行底物UFM化檢測(cè)所需的最佳UFM化組件組合，研究人員采用了單因素實(shí)驗(yàn)。

在DKO細(xì)胞中，當(dāng)僅轉(zhuǎn)染空載體時(shí)，內(nèi)源性UFM化被完全阻斷；而當(dāng)轉(zhuǎn)染成熟的UFM1ΔC2時(shí)，UFM化得以恢復(fù)�；�于此，他們建立了包含所有關(guān)鍵UFM化組件（UBA5、UFC1、UFL1和DDRGK1）的共轉(zhuǎn)染組作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染混合物中是否存在UBA5或UFC1對(duì)細(xì)胞內(nèi)UFM化水平幾乎沒(méi)有影響。相比之下，外源表達(dá)UFL1和DDRGK1在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)UFM化水平方面起著顯著作用。

為了進(jìn)一步闡明E3連接酶復(fù)合體組分UFL1和DDRGK1在UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞底物修飾中的作用，他們利用單因素實(shí)驗(yàn)和免疫沉淀對(duì)ASC1進(jìn)行了UFM化檢測(cè)。結(jié)果表明，缺少UFL1或DDRGK1會(huì)導(dǎo)致ASC1的UFM化水平顯著下降，而UFL1和DDRGK1的存在足以支持相當(dāng)水平的UFM1偶聯(lián)ASC1。同時(shí)，他們利用主要的細(xì)胞內(nèi)UFM化底物RPL26重復(fù)了這些單因素實(shí)驗(yàn)，并得到了一致的結(jié)論。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)證明E3連接酶組分UFL1和DDRGK1對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)UFM化水平至關(guān)重要，并且它們的外源共表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞中的底物UFM化。

迄今為止，只有有限數(shù)量的UFM化底物被鑒定，已報(bào)道的不足30個(gè)。這種稀缺性限制了對(duì)UFM化生物學(xué)功能的理解。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，外源表達(dá)的UFL1、DDRGK1和UFM1ΔC2在UFSP1^KO/UFSP2^KO細(xì)胞（DKO-ΔC2）中表現(xiàn)出顯著升高的UFM化水平。

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)UFM化底物的大規(guī)模鑒定，他們開(kāi)發(fā)了一種高效方法，利用K-ε-GV抗體高效富集UFM1修飾的肽段，并最終采用LC-MS/MS在DKO-ΔC2樣品中特異性鑒定UFM化位點(diǎn)。UFM化會(huì)在靶標(biāo)賴(lài)氨酸（K）殘基上引起+156.09 Da的特異性質(zhì)量位移，這源于UFM1 C末端酶切后產(chǎn)生的甘氨酸-纈氨酸（GV）二肽殘留物的共價(jià)連接。令人驚訝的是，他們鑒定出了超過(guò)600個(gè)底物，這個(gè)數(shù)字遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)先前報(bào)道的數(shù)量。重疊的底物包括了核心的UFM化組分和幾個(gè)先前報(bào)道的底物。此外，鑒定出的偶聯(lián)位點(diǎn)與之前的發(fā)現(xiàn)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了他們數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性。

隨后，他們從列表中選擇五個(gè)代表性蛋白（HSP90α、YEATS2、ANXA5、ANXA6、PRMT5）進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所有候選蛋白都能被UFM1分子偶聯(lián)，并且它們的修飾能被UFSP2去偶聯(lián)。此外，內(nèi)源性修飾測(cè)定的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這五個(gè)候選蛋白確實(shí)是UFM化底物。簡(jiǎn)而言之，這些結(jié)果證明了成功開(kāi)發(fā)了一種可靠的策略，用于大規(guī)模鑒定細(xì)胞內(nèi)UFM化底物。

目前，對(duì)于泛素化和SUMO化等PTM已有可用的位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，但對(duì)于UFM化位點(diǎn)則沒(méi)有。這一限制歸因于已知的UFM化底物數(shù)量較少。根據(jù)他們的LC-MS/MS數(shù)據(jù)，研究人員試圖通過(guò)使用基于基序的序列分析工具檢查UFM1殘留的K-ε-GV序列片段，來(lái)分析特定賴(lài)氨酸殘基的修飾模式。他們的分析表明，與賴(lài)氨酸和精氨酸（Arg, R）殘基相比，在被UFM1偶聯(lián)的靶標(biāo)賴(lài)氨酸殘基相鄰位置（上游或下游一個(gè)殘基）的甘氨酸殘基和酪氨酸（Tyr, Y）殘基的保守性更高。此外，他們研究了這些底物的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示UFM化底物主要定位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜。功能注釋分析表明，UFM化底物主要參與多個(gè)細(xì)胞通路，包括翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)為開(kāi)發(fā)UFM化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具的基序或位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)，并為未來(lái)研究UFM化功能提供了關(guān)鍵見(jiàn)解。

本研究成功建立了一個(gè)高效、可靠的UFM化研究平臺(tái)。通過(guò)構(gòu)建UFSP1^KO/UFSP2^KO雙敲除HEK293T細(xì)胞系，并優(yōu)化外源表達(dá)E3連接酶組分UFL1和DDRGK1，研究人員顯著提升了蛋白質(zhì)UFM化水平，克服了傳統(tǒng)方法效率低、不穩(wěn)定的問(wèn)題。最重要的是，他們利用特異性識(shí)別UFM1殘留基序（K-ε-GV）的抗體結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了UFM化底物的大規(guī)模鑒定，一舉將已知底物數(shù)量從不足30個(gè)擴(kuò)展到超過(guò)600個(gè)，取得了突破性進(jìn)展。

這項(xiàng)工作不僅為UFM化研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)工具，而且通過(guò)生物信息學(xué)分析，初步揭示了UFM化位點(diǎn)周?chē)�的氨基酸偏好性以及底物蛋白的亞�?xì)胞定位和功能富集情況，為理解UFM化的功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了寶貴的數(shù)據(jù)集和理論依據(jù)。該研究建立的方法學(xué)未來(lái)可應(yīng)用于更具特定生物學(xué)或病理學(xué)背景的細(xì)胞模型，有助于篩選與目標(biāo)生物過(guò)程或疾病條件更相關(guān)的UFM化底物候選分子，從而為深入探究UFM化在人類(lèi)健康和疾病中的分子機(jī)制提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。盡管研究存在一些局限性，例如主要基于HEK293T細(xì)胞系以及可能遺漏某些低豐度底物，但其建立的高效鑒定策略無(wú)疑將為整個(gè)UFM化研究領(lǐng)域打開(kāi)新局面，推動(dòng)對(duì)該重要翻譯后修飾系統(tǒng)的功能探索進(jìn)入一個(gè)更廣闊的天地。