《Journal of Chromatography B》：Resolving Biclonal Gammopathy from monoclonal patterns: Diagnostic utility of triple quadrupole mass spectrometry in the era of therapeutic monoclonal antibodies
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該研究通過液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術結合免疫富集法，分析14份血清樣本中雙帶現象的成因。結果顯示：7份IgG樣本中2例為真雙克隆，3例為單克隆伴結構變異（糖基化差異）；6份IgA樣本均為單克隆；1份IgMκ樣本為雙克隆。該方法成功區分了單克隆、雙克隆、單抗干擾（ Daratumumab）及糖基化變異，證實質譜技術可提升γ-珠蛋白病診斷準確性。
作者：Ankitha K. Puthiyaveettil、Sujay Ramaprasad、Deepalakshmi D. Putchen
研究機構：Neuberg Anand Academy of Laboratory Medicine Pvt Ltd，印度班加羅爾
摘要
雙克隆丙種球蛋白病在大約1%的骨髓瘤病例中被觀察到，通常通過血清蛋白電泳（SPEP）和免疫固定電泳（IFE）進行檢測。當兩條帶具有相同的重鏈-輕鏈同型時（例如IgGκ/IgGκ），解讀結果會變得具有挑戰性，因為僅憑視覺評估可能會錯誤地分類克隆性。這種模式可能由結構異常的免疫球蛋白變體（二聚體、翻譯后修飾）、治療性單克隆抗體（tMAb）的干擾或真正的雙克隆性引起。在這項研究中，采用了液相色譜-三重四極桿質譜（LC-TQMS）技術來測定輕鏈的質量，并以高特異性區分這些可能性。14份在IFE上顯示相同同型雙帶的殘余血清樣本首先使用駱駝科動物抗體包被的瓊脂糖珠進行同型特異性免疫富集，然后進行化學還原和LC-TQMS分析。κ輕鏈的質量范圍為22,973–23,574 Da，而更高的κ輕鏈質量（24,284 Da和25,942 Da）出現在IgM同型中。λ輕鏈的質量介于22,604至22,820 Da之間。在7份IgG樣本中，有2份樣本確認為雙克隆性，3份為單克隆性，2份為tMAb干擾（達拉妥單抗）。所有6份IgA樣本均為單克隆性，而1份IgM樣本顯示雙克隆性。IgG和IgM輕鏈分別觀察到了糖基化（己糖Δm 162 ± 10 Da，唾液酸化Δm 292 ± 10 Da）。因此，LC-TQMS方法有效地區分了雙帶病例，明確了雙克隆性、單克隆性、tMAb干擾和結構變異。
影響聲明
1) 解決了血清蛋白電泳或免疫固定電泳中顯示雙帶模式的診斷不確定性。
2) 提供了輕鏈的精確質量信息，以實現準確表征。
3) 能夠區分雙克隆性、單克隆性、治療性干擾和糖型。
4) 展示了治療性單克隆抗體或結構異常的免疫球蛋白變體（如糖基化）如何使單克隆模式的解讀復雜化。
5) 降低了誤分類的風險，提高了診斷準確性和患者管理。
6) 通過將分子精度整合到常規臨床工作中，推動了實驗室診斷的發展。
引言
漿細胞異常是一組異質性疾病，其特征是分泌免疫球蛋白的漿細胞克隆擴增[1]，通常在循環中表現為單克隆免疫球蛋白（M蛋白）[2]。雖然大多數疾病涉及單個漿細胞克隆，但有一小部分病例表現出相同重鏈和輕鏈同型的雙帶，例如IgGκ或IgMκ類型。這些模式在常規檢測方法（如血清蛋白電泳（SPEP）[3]和免疫固定電泳（IFE）[4]中可能表現為雙克隆性，盡管潛在的克隆性可能涉及單個克隆，無論是否有治療性干擾或結構變異。真正的雙克隆性是指由兩個不同的漿細胞克隆產生兩種不同重鏈-輕鏈組合的免疫球蛋白，例如IgGκ與IgAλ或IgMλ與IgGλ或IgMκ，這代表了與相同同型雙帶不同的生物學現象[5]。
在SPEP中，雙克隆性通常通過β2或γ區域出現兩個明顯的M峰來提示。然而，聚合的免疫球蛋白（特別是IgM和IgA）可能會產生人為的雙M峰。使用還原劑（如β-巰基乙醇（βME）處理可以將其分解為單個單克隆帶，從而揭示真實的潛在模式。Orr等人[6]在IgM丙種球蛋白病中展示了這種方法，βME處理有助于檢測和分類單克隆蛋白，因為聚合形式在IFE中會顯示為多個帶。盡管這些技術很有用，但電泳和免疫固定技術無法可靠地區分翻譯后修飾的形式（糖基化輕鏈）、治療性單克隆抗體的干擾或構象變化，這是常規實踐中的一個關鍵診斷空白。
此外，IFE檢測到的雙克隆性的生物學有效性往往不確定，因為許多最初被報告為雙克隆性的病例實際上是單克隆性的，涉及結構變異（如糖基化）和治療性單克隆抗體的干擾[7]。例如，用于治療多發性骨髓瘤的抗CD38抗體達拉妥單抗（IgGκ同型）在IFE中可能表現為離散的IgGκ帶。這些治療相關帶可能與內源性單克隆蛋白非常相似，導致誤判為第二種M蛋白。在基于單克隆抗體的治療時代，這種干擾變得越來越重要，強調了需要補充方法來準確確定克隆性[8]。
質譜（MS）憑借其高分析靈敏度和特異性，已成為檢測和表征單克隆丙種球蛋白病的有效技術。與IFE相比，MS具有更高的特異性和靈敏度[9]，因為它可以測定完整輕鏈的質量，準確區分單克隆性和雙克隆性模式以及治療性干擾[10]。盡管越來越多的證據支持質譜的診斷效用，但專門針對相同同型雙克隆丙種球蛋白病的研究仍然較少。Fatica等人[7]表明，結合MALDI-TOF MS（Mass-Fix）的免疫富集可以區分單克隆蛋白的單體-二聚體形式、治療性單克隆抗體的干擾、輕鏈糖基化或真正的雙克隆蛋白。在他們的研究隊列中，大多數在IFE中顯示為雙克隆性的樣本在MS重新檢測時實際上是單克隆性的，占IgG病例的67%和IgA病例的93%，只有少數為雙克隆性丙種球蛋白病。這些發現突顯了僅依靠電泳方法可能導致的誤分類率高，并強調了補充方法在M蛋白表征中的價值[7]。
MALDI-ToF MS結合了樣品制備和自動化分析，已經在一些臨床實驗室中取代了IFE[11]。對于模糊或陰性的MALDI-MS結果，可以進一步使用高分辨率質譜（HRMS）進行檢測，后者能更精確地檢測低豐度或復雜的單克隆物種，包括那些被tMAb干擾掩蓋的物種[12]。由于儀器和維護成本高昂，許多診斷實驗室無法使用HRMS。我們實驗室配備了三重四極桿質譜（TQMS），通常用于測量小分子（包括治療藥物、類固醇激素和其他代謝物）[13][14][15][16]，這促使我們探索其用于測量輕鏈質量的可能性。我們實驗室的初步研究表明，可以檢測到雙克隆性、單克隆性、達拉妥單抗的干擾和糖基化輕鏈[17][18]。
本研究旨在評估相同同型雙帶的克隆性，并強調達拉妥單抗（tMAb）和輕鏈翻譯后修飾（糖基化）在M蛋白解讀中帶來的診斷挑戰。
倫理批準
本研究得到了機構人類倫理委員會的批準（批準編號：EC/NEW/INST/2022/2627）。該項目的具體批準編號為NAALM/EC/3.3/03–2022。由于僅分析了匿名殘余血清樣本，委員會免除了患者同意的要求。
樣本
樣本來自2022年1月至2025年4月期間的患者殘余血清。選擇這些樣本的標準是存在雙帶模式。
結果
本研究分析了14份在IFE上顯示相同同型（G,A,M）和輕鏈（κ,λ）雙帶的患者血清樣本。樣本包括10名男性和4名女性，年齡范圍為52至89歲。其中有7份IgG樣本（6份IgGκ和1份IgGλ）、6份IgA樣本（4份IgAκ和2份IgAλ）以及1份IgMκ樣本。在2份IgG樣本（S3和S5）和2份IgA樣本（S8和S12）中，由于雙帶持續存在，被診斷為雙克隆性。
討論
IFE上相同同型雙帶的解讀是一個公認的診斷挑戰。在某些樣本中，使用β-巰基乙醇（βME）處理后，這些雙帶分解為單個單克隆成分，證實它們來自同一克隆[3][4]。在使用tMAb的情況下，情況更加復雜，特別是IgGκ抗體，因為它們在IFE中會產生額外的帶，可能模仿雙克隆性或掩蓋內源性克隆。反射檢測
人工智能輔助
作者使用ChatGPT（OpenAI）幫助起草和修改手稿的某些部分。所有科學內容、數據解讀和結論均由作者完成和驗證。
作者貢獻聲明
Ankitha K. Puthiyaveettil：撰寫原始草稿、項目管理、方法學、研究、正式分析。
Sujay Ramaprasad：撰寫和編輯、資源管理、概念構思。
Deepalakshmi D. Putchen：撰寫和編輯、撰寫原始草稿、監督、項目管理、方法學、研究、正式分析、概念構思。
資金
本研究未申請任何資金。
利益沖突聲明
作者聲明以下財務利益/個人關系可能被視為潛在的利益沖突：Sujay Ramaprasad與Neuberg Anand Academy of Laboratory Medicine Pvt. Ltd.有關聯，包括股權或股票。所有其他作者聲明沒有已知的可能影響本文工作的財務利益或個人關系。
致謝
作者感謝A. Prajwal博士在雙帶模式解讀方面的有益討論，感謝S. Priyanka女士協調樣本收集，感謝A. Saikumar先生對患者數據的匿名處理，以及實驗室技術人員的支持。作者還感謝Thermo Fisher Scientific Pvt. Ltd.提供的κ和λ輕鏈珠，以及Waters (India Pvt. Ltd.)提供的去卷積軟件（MaxEnt1）。
