心肌梗死后的延遲炎癥消退是導致不良心臟重塑和心力衰竭的關鍵因素。中性粒細胞作為最先浸潤梗死心肌的免疫細胞，其及時清除對于炎癥的適時消退至關重要。巨噬細胞介導的、對凋亡中性粒細胞的胞葬作用是清除中性粒細胞的主要方式，但其中的具體調控機制尚不明確。免疫相關GTP酶（IRG）家族成員Irgm1（人類對應基因為IRGM）在感染和自身免疫疾病中的作用已有研究，但其在心血管疾病，特別是心肌梗死后心臟修復中的作用鮮有報道。本研究旨在探索Irgm1是否以及如何調控心肌梗死后中性粒細胞的清除和胞葬作用。

研究人員發現，心肌梗死患者外周血中性粒細胞中的IRGM表達顯著升高，且其表達水平與更好的預后指標（如較低的NT-proBNP、cTnI、CK-MB、CRP、IL-6、IL-1β水平）呈負相關。在心肌梗死小鼠模型中，心臟浸潤的中性粒細胞及外周血中性粒細胞中的Irgm1蛋白水平也顯著上調。生物信息學分析和免疫熒光染色進一步證實，Irgm1在梗死心臟中主要與中性粒細胞標志物Ly6G、MPO和NE共定位，提示Irgm1在中性粒細胞中特異性表達，并與心肌梗死后心臟損傷減輕及預后改善密切相關。

為了探究Irgm1的功能，研究團隊構建了中性粒細胞特異性Irgm1敲除小鼠。與野生型小鼠相比，Irgm1敲除小鼠在心肌梗死后28天的存活率更低，血清肌鈣蛋白水平更高，表明心肌損傷更嚴重。超聲心動圖評估顯示，敲除小鼠的左心室射血分數和縮短分數顯著降低，而左心室內徑和舒張末期容積增大，提示心室擴張和功能惡化更嚴重。TTC染色和Masson三色染色進一步證實，Irgm1敲除小鼠在梗死第3天和第28天分別表現出更大的梗死面積和纖維化瘢痕面積。這些結果表明，中性粒細胞Irgm1缺失會加劇心肌梗死后的心臟功能障礙、促進不良重塑和纖維化。

研究進一步評估了修復過程。TUNEL染色顯示，Irgm1敲除小鼠在梗死邊緣區的心肌細胞凋亡更為嚴重。在修復期（梗死后第7天），敲除小鼠梗死區膠原III表達減少，而促纖維化的肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白表達增加，同時微血管密度降低。促纖維化基因（Col3a1, Col1a1, α-SMA）表達上調，而修復型巨噬細胞標志物Arginase 1表達下調。這些數據表明，Irgm1缺失損害了血管新生，加劇了細胞凋亡和纖維化，不利于組織修復。

在炎癥消退方面，H&E和免疫組化染色發現，Irgm1敲除小鼠在梗死后第3天，心臟梗死區及邊緣區有更密集的炎癥細胞浸潤，特別是Ly6G⁺中性粒細胞數量顯著增加。雖然巨噬細胞數量無差異，但細胞因子檢測顯示，敲除小鼠血漿中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低。心臟組織中促炎基因表達上調，抗炎基因表達下調，且修復型Arg-1⁺巨噬細胞減少。這些結果表明Irgm1缺失延遲了心肌梗死后的炎癥消退。

為探究中性粒細胞增多的原因，研究團隊通過流式細胞術分析了中性粒細胞在心臟、血液和骨髓中的動態變化。結果顯示，在梗死早期（24小時），兩組小鼠心臟中的中性粒細胞數量無差異；但在48小時、72小時和7天時，Irgm1敲除小鼠心臟中的中性粒細胞數量顯著高于野生型小鼠。而在血液和骨髓中，兩組的中性粒細胞數量在所有時間點均無顯著差異。這表明Irgm1缺失并不影響中性粒細胞的生成、動員或早期招募，而是損害了其在心臟組織中的后期清除。

功能實驗表明，Irgm1缺失不影響中性粒細胞表面粘附分子LFA-1和Mac-1的表達，也不影響其與內皮細胞的粘附能力。然而，免疫熒光染色顯示，敲除小鼠心臟中巨噬細胞對中性粒細胞的胞葬作用顯著減弱。體外共培養實驗進一步證實，與野生型中性粒細胞共培養時，骨髓來源巨噬細胞的胞葬作用更強，且表現出更高的抗炎表型（Arg-1和IL-10表達升高）；而與Irgm1敲除中性粒細胞共培養時，巨噬細胞的胞葬作用和抗炎表型均受損。補充重組Irgm1蛋白可以部分恢復這種缺陷。

中性粒細胞清除的主要途徑是凋亡后的胞葬作用。研究發現，Irgm1敲除小鼠心臟中的中性粒細胞凋亡減少，流式細胞術檢測顯示早期凋亡標志物磷脂酰絲氨酸暴露減少。體內過繼轉移實驗直接證明，注射到心肌梗死野生型小鼠體內的Irgm1敲除中性粒細胞，其存活數量顯著高于野生型中性粒細胞，表明Irgm1缺失延長了中性粒細胞的體內存活時間。

體外實驗中，使用特異性結合早期磷脂酰絲氨酸的乳粘蛋白進行染色，發現經LPS刺激后，野生型中性粒細胞出現明顯的磷脂酰絲氨酸暴露，而Irgm1敲除中性粒細胞則顯著減少。碘化丙啶共染色顯示，敲除組中有更多細胞處于碘化丙啶陽性但無磷脂酰絲氨酸暴露的狀態（即晚期凋亡/壞死），而健康細胞比例更高。臺盼藍染色計數也證實，敲除組中健康中性粒細胞的絕對數量更多，死亡細胞更少。機制上，Irgm1缺失導致cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低。使用caspase-3激活劑Raptinal處理可以部分恢復Irgm1敲除中性粒細胞的磷脂酰絲氨酸暴露和胞葬作用；而使用抑制劑Z-DEVD-FMK則會抑制野生型中性粒細胞的這些過程。因此，Irgm1通過調控caspase-3通路來促進中性粒細胞凋亡和清除。

為了尋找Irgm1的上游作用靶點，研究進行了免疫沉淀聯合質譜分析和RNA測序。質譜分析將蛋白質二硫鍵異構酶A3鑒定為Irgm1的潛在相互作用蛋白。RNA測序和q-PCR顯示PDIA3的mRNA水平無變化，但其蛋白水平在Irgm1敲除中性粒細胞中顯著升高，提示Irgm1在翻譯后水平調節PDIA3。

分子對接模擬顯示兩者可形成穩定氫鍵。免疫熒光、免疫共沉淀和鄰位連接技術實驗均證實了Irgm1與PDIA3在細胞質內直接相互作用。在HL-60細胞（中性粒細胞樣細胞系）中，敲低IRGM導致PDIA3蛋白水平升高，而過表達IRGM則降低其水平，且不影響其mRNA。環己酰亞胺實驗表明，Irgm1缺失顯著延長了PDIA3蛋白的半衰期。使用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1可以阻斷Irgm1介導的PDIA3降解，而蛋白酶體抑制劑MG132則不能，證明該降解依賴于自噬途徑而非泛素-蛋白酶體系統。進一步實驗證實，Irgm1和PDIA3均與自噬接頭蛋白p62相互作用，且在自噬關鍵蛋白ATG5缺失的情況下，IRGM無法降解PDIA3。

PDIA3是內質網應激的關鍵調節因子。透射電鏡觀察發現，LPS刺激后，野生型中性粒細胞的內質網發生腫脹，顯示出應激形態；而Irgm1敲除中性粒細胞的內質網腫脹減輕，體積變小，內質網應激標志物GRP78的表達也降低。使用PDIA3抑制劑LOC14處理可以部分恢復敲除細胞的內質網應激水平、磷脂酰絲氨酸暴露和胞葬作用。

RNA測序的基因集富集分析表明，Irgm1缺失與NF-κB信號通路的下調顯著相關。NF-κB/caspase-3是誘導凋亡的關鍵通路。免疫印跡顯示，Irgm1敲除中性粒細胞中，內質網應激標志物（GRP78, ATF6）、磷酸化P65 (p-P65) 和cleaved caspase-3的水平均降低。在HL-60細胞中過表達IRGM則得到相反的結果。使用內質網應激抑制劑4-PBA處理，會降低GRP78、ATF6、p-P65和cleaved caspase-3的水平，并同時抑制中性粒細胞的磷脂酰絲氨酸暴露和胞葬作用。這些結果證明，Irgm1通過與PDIA3相互作用并促進其通過自噬途徑降解，從而解除PDIA3對內質網應激的抑制，激活下游的NF-κB/caspase-3信號軸，最終促進中性粒細胞的凋亡和清除。

基于上述機制，研究評估了靶向PDIA3是否具有治療潛力。研究人員對心肌梗死后的野生型和Irgm1敲除小鼠連續7天腹腔注射PDIA3抑制劑LOC14。結果顯示，LOC14處理部分恢復了敲除小鼠中性粒細胞的內質網應激水平。更重要的是，LOC14治療顯著改善了兩種小鼠的心功能，提高了射血分數和縮短分數，減少了左心室擴張，縮小心肌梗死面積和纖維化瘢痕面積，并增強了心臟中的中性粒細胞胞葬作用。同時，LOC14下調了促纖維化基因的表達，上調了巨噬細胞修復表型相關基因的表達。在假手術小鼠中，LOC14處理未引起心功能或組織結構的明顯變化，說明其作用具有病理狀態特異性。這些發現表明，靶向Irgm1-PDIA3軸，特別是使用PDIA3抑制劑LOC14，有望成為改善心肌梗死后心臟修復，尤其是針對Irgm1功能缺失個體的潛在治療策略。