急性心肌梗死是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，而血運(yùn)重建治療（如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療PCI）是恢復(fù)缺血心肌血流的標(biāo)準(zhǔn)療法。然而，再灌注本身會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性心肌損傷，即心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷。盡管對(duì)再灌注期間的病理生理變化已有諸多研究，但如何將這些機(jī)制整合并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的細(xì)節(jié)仍不清楚，且少有發(fā)現(xiàn)能成功轉(zhuǎn)化為有效療法。MI/R損傷的窗口期狹窄，一旦梗死面積形成即不可逆轉(zhuǎn)。因此，識(shí)別驅(qū)動(dòng)MI/R損傷早期發(fā)作的內(nèi)在因素和機(jī)制至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，在MI/R小鼠模型中，中性粒細(xì)胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺）在再灌注后3小時(shí)即迅速浸潤(rùn)心肌組織，并在12小時(shí)達(dá)到高峰，而巨噬細(xì)胞則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。蛋白組學(xué)分析也顯示，中性粒細(xì)胞相關(guān)蛋白（如LCN2、S100A8）是MI/R后心肌組織中變化最顯著的蛋白之一。使用Ly6G中和抗體特異性清除中性粒細(xì)胞，能顯著減小MI/R小鼠的梗死面積、減少細(xì)胞死亡，并降低炎癥因子和心肌損傷標(biāo)志物水平，表明中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是MI/R的早期致病標(biāo)志。

研究證實(shí)，MI/R條件下，浸潤(rùn)到心肌組織的中性粒細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷GSDMD依賴(lài)性NETosis，從而加重心肌損傷。在MI/R小鼠中，炎性caspase-1和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）在術(shù)后6小時(shí)即被激活，GSDMD的活化也先于凋亡執(zhí)行蛋白PARP的大量激活。藥理學(xué)抑制caspase-1（vx-765）或NE（sivelestat）可使小鼠對(duì)MI/R誘導(dǎo)的心肌梗死不敏感。此外，Gsdmd^-/-小鼠在MI/R后未表現(xiàn)出明顯的NETs形成，但中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)比例未變。將Gsdmd^-/-中性粒細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到清除了中性粒細(xì)胞的受體小鼠體內(nèi)，可顯著減少NETs形成并減輕MI/R損傷。這些數(shù)據(jù)證明，清除中性粒細(xì)胞中的GSDMD足以減少NETs形成并減輕MI/R損傷。

NETosis在再灌注后6小時(shí)即發(fā)生，早于炎性細(xì)胞因子大量升高和明顯的細(xì)胞死亡。體外實(shí)驗(yàn)表明，靜息的中性粒細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，但被PMA預(yù)激活或分離出的NETs能直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。在體內(nèi)，使用NETs抑制劑DNase I或Cl-amidine hydrochloride能顯著消除NETs，并有效減輕再灌注后24小時(shí)的心臟損傷。這些結(jié)果證明，NETosis在MI/R損傷發(fā)作期即出現(xiàn)，是促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡和加劇梗死的因果因素。

為了探究MI/R期間NETs如何形成，研究者使用了體外缺氧/復(fù)氧（H/R）模型。來(lái)自H/R處理后心肌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（HRCM）能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的中性粒細(xì)胞死亡和核成分?jǐn)D出，形成類(lèi)似PMA誘導(dǎo)的典型NETs。進(jìn)一步分離發(fā)現(xiàn)，只有小分子組分（分子量 < 6 kDa）能誘導(dǎo)NETosis，而大分子組分無(wú)效。蛋白酶K或DNase I處理的HRCM仍能誘導(dǎo)NETosis，提示損傷心肌細(xì)胞分泌的代謝因子可能是激活NETosis的原因。

通過(guò)篩選包含829種化合物的內(nèi)源性代謝物庫(kù)，研究者發(fā)現(xiàn)血小板活化因子（PAF）是最有效的NETosis激活劑之一，其IC₅₀為320 nM。PAF是一種在MI/R臨床過(guò)程中釋放的炎癥介質(zhì)，與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素顯著相關(guān)。機(jī)制上，PAF誘導(dǎo)的NETosis依賴(lài)于GSDMD，但不依賴(lài)于caspase-1或caspase-11，而是依賴(lài)于中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）。Elane^-/-（NE缺陷）中性粒細(xì)胞對(duì)PAF介導(dǎo)的NETosis具有抵抗力，且PAF處理下GSDMD的切割和膜定位減少。藥理學(xué)抑制NE（sivelestat）能顯著減少PAF誘導(dǎo)的NETs形成和GSDMD切割。與經(jīng)典炎癥小體介導(dǎo)的GSDMD處理不同，PAF不激活炎性caspases和IL-1β釋放，但能導(dǎo)致網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成和細(xì)胞膜破裂，以及N-GSDMD與NETs共定位。這些發(fā)現(xiàn)揭示了NE依賴(lài)性GSDMD切割和NETs形成參與了PAF介導(dǎo)的NETosis。

在MI/R過(guò)程中，心肌組織中的PAF在再灌注后3小時(shí)的早期階段即顯著升高。PAF的合成主要通過(guò)兩條途徑：由PLA2和LPCAT2介導(dǎo)的重塑途徑，以及需要CHPT1酶的從頭合成途徑。研究發(fā)現(xiàn)，參與重塑途徑的關(guān)鍵酶Pla2g6在MI/R小鼠體內(nèi)和H/R條件下的心肌細(xì)胞中均顯著上調(diào)。選擇性PLA2G6抑制劑S-Bromoenol lactone（S-BEL）能抑制H/R處理心肌細(xì)胞中的PAF產(chǎn)生，并延緩HRCM誘導(dǎo)的NETosis。

在體內(nèi)，抑制PLA2G6（使用S-BEL）或PAF受體（使用rilapladib）均能顯著減輕MI/R損傷，減少心臟PAF濃度和NETs形成。在Gsdmd^-/-小鼠中，抑制PLA2G6并未顯示出進(jìn)一步的保護(hù)作用，表明PAF加劇MI/R損傷在很大程度上依賴(lài)于GSDMD/NETosis通路。這些數(shù)據(jù)證明，心肌細(xì)胞來(lái)源的PAF觸發(fā)的NETosis是MI/R損傷的關(guān)鍵誘因，而PAF在損傷心肌組織中的積累與PLA2G6的上調(diào)密切相關(guān)。

為了尋找潛在的NETosis抑制劑，研究者使用PMA和PAF誘導(dǎo)的NETosis模型篩選了1499種FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑達(dá)格列凈（Dapagliflozin）表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制效力（約80%）。達(dá)格列凈能抑制NETs形成和NETosis，并減少N-GSDMD的產(chǎn)生。值得注意的是，達(dá)格列凈對(duì)NETosis的抑制作用不依賴(lài)于SGLT2，因?yàn)樗��?i>Slc5a2^-/-（SGLT2敲除）中性粒細(xì)胞中也顯示出等效的抑制效果。其他SGLT2抑制劑（如恩格列凈、卡格列凈、埃格列凈）也能抑制NETosis，但效果較弱。

預(yù)給藥達(dá)格列凈能顯著減輕MI/R小鼠的心臟梗死面積、纖維化和NETosis，但不影響心臟組織中的PAF水平。其心臟保護(hù)作用也是SGLT2非依賴(lài)性的，因?yàn)樗��?i>Slc5a2^-/-小鼠中同樣有效。在過(guò)繼轉(zhuǎn)移了Gsdmd^-/-中性粒細(xì)胞的小鼠中，達(dá)格列凈無(wú)法再提供保護(hù)，表明GSDMD-NETosis信號(hào)通路是介導(dǎo)達(dá)格列凈心臟保護(hù)活性所必需的。

為了解析達(dá)格列凈抑制NETosis的潛在靶點(diǎn)，研究者采用了有限蛋白酶解偶聯(lián)質(zhì)譜（LiP-MS）方法。分析發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈特異性結(jié)合并改變了中性粒細(xì)胞來(lái)源的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2（LCN2）的蛋白水解模式。分子對(duì)接和結(jié)構(gòu)分析進(jìn)一步支持了達(dá)格列凈與LCN2的結(jié)合。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默LCN2會(huì)減弱達(dá)格列凈對(duì)NETosis的保護(hù)作用，而過(guò)表達(dá)LCN2則可挽救此表型。表面等離子共振（SPR）分析驗(yàn)證了達(dá)格列凈與重組人LCN2蛋白的直接相互作用，其平衡解離常數(shù)（K_D）為2.7 × 10^-7M。因此，達(dá)格列凈通過(guò)直接靶向LCN2來(lái)抑制PAF誘導(dǎo)的NETosis，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

對(duì)72名接受PCI手術(shù)的急性心肌梗死（AMI）患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者血清中的NETs標(biāo)志物（如cfDNA）和PAF濃度均升高。值得注意的是，其中7名長(zhǎng)期服用達(dá)格列凈的糖尿病患者，其PCI術(shù)后心臟損傷和NETosis指標(biāo)顯著降低。血清PAF濃度與cfDNA水平呈正相關(guān)，且cfDNA、LCN2和PAF水平與LDH、CK、CK-MB、S100A8/A9等心肌損傷標(biāo)志物也呈正相關(guān)。這些臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了NETosis與接受PCI手術(shù)的AMI患者不良預(yù)后相關(guān)，而長(zhǎng)期使用達(dá)格列凈可能對(duì)心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)患者具有治療益處。

該研究系統(tǒng)闡明了MI/R損傷早期免疫代謝與細(xì)胞死亡模式之間的動(dòng)態(tài)相互作用。研究確定中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和NETosis是MI/R損傷的早期因果因素。心臟細(xì)胞在MI/R期間釋放的PAF通過(guò)激活NE和GSDMD，驅(qū)動(dòng)NETs形成和NETosis。PAF的積累與PLA2G6酶活性增強(qiáng)有關(guān)。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)降糖藥達(dá)格列凈是一種有效的NETosis抑制劑，它能通過(guò)靶向LCN2（而非SGLT2）來(lái)抑制PAF-NETosis軸，從而保護(hù)小鼠免受MI/R損傷。臨床數(shù)據(jù)也支持達(dá)格列凈對(duì)PCI術(shù)后心肌損傷的緩解作用與抑制NETosis相關(guān)。這項(xiàng)工作為MI/R損傷中的早期免疫代謝串?dāng)_提供了新的機(jī)制見(jiàn)解，并將PAF-NETosis軸確立為一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)。