為了系統鑒定維持膠質瘤干細胞（GSCs）干性的核心調控因子，研究團隊收集了正常腦組織、低級別膠質瘤和高級別膠質瘤的臨床樣本進行分析。通過蛋白芯片分析發現，NIBAN2（又稱FAM129B）在膠質瘤組織中顯著高表達，且表達水平與腫瘤級別呈正相關。蛋白質印跡、定量PCR和免疫組織化學染色結果一致顯示，與正常腦組織相比，NIBAN2在膠質瘤組織中上調。從患者樣本中建立的八株原代膠質母細胞瘤細胞系及其誘導的GSCs分析表明，與親本細胞相比，GSCs中NIBAN2表達普遍增高。對TCGA數據庫的分析進一步證實，NIBAN2在膠質瘤組織中高表達，并且其高表達與患者的不良預后顯著相關，提示NIBAN2可能是膠質瘤進展和GSC維持的關鍵調控因子。

研究團隊通過一系列體外和體內功能實驗證實了NIBAN2對GSC惡性表型的促進作用。在腫瘤球形成實驗中，過表達NIBAN2顯著增強了GSC在無血清、低黏附條件下的成球能力，所形成的腫瘤球數量更多、體積更大。極限稀釋實驗分析顯示，過表達NIBAN2顯著提高了干細胞頻率。軟瓊脂集落形成實驗也表明，NIBAN2增強了GSC的錨定非依賴性生長能力。蛋白質印跡分析顯示，過表達NIBAN2上調了CD133、CD44、NANOG和Nestin等經典的干性標志物表達。在體內，將過表達NIBAN2的GSC原位注射到免疫缺陷小鼠顱內后，小鼠生存期顯著縮短，腫瘤發生率更高，體積更大，且腫瘤組織中SOX2和Ki-67表達上調。相反，敲低NIBAN2則導致上述惡性表型減弱。這些結果共同表明，NIBAN2是GSC維持干樣表型和惡性功能狀態的關鍵正向調控因子。

為闡明NIBAN2調控GSC干性的分子機制，研究者進行了免疫共沉淀偶聯質譜分析，并鑒定出Flightless I（FLII）是NIBAN2的關鍵結合蛋白。隨后的免疫共沉淀實驗證實了NIBAN2與內源性FLII在GSCs中存在相互作用。GST pull-down實驗進一步驗證了NIBAN2與FLII在體外能夠直接結合。通過免疫熒光和核質分離實驗發現，在對照GSC中，FLII主要定位于細胞質；而過表達NIBAN2則顯著促進了FLII的核轉位，使其與NIBAN2在核內強烈共定位。相反，敲低NIBAN2則損害了FLII的核定位，使其滯留在細胞質中。這表明NIBAN2不僅與FLII形成穩定復合物，還促進了其從細胞質到細胞核的轉位，這可能有助于其介導的GSC干性維持。

為了驗證NIBAN2介導的GSC干性和惡性表現是否依賴于FLII，研究者在過表達NIBAN2的背景下敲低了FLII。功能拯救實驗顯示，FLII敲低顯著減弱了由NIBAN2過表達引起的腫瘤球形成能力增強、干細胞頻率升高以及軟瓊脂集落形成能力增強。蛋白質印跡分析也表明，FLII敲低抑制了NIBAN2誘導的CD44、CD133、NANOG和Nestin等干性標志物的上調。在體內，過表達NIBAN2顯著縮短了小鼠的生存期，而同時敲低FLII則能顯著延長生存期，幾乎恢復到對照組水平，并且腫瘤體積和侵襲性也得到抑制。組織學分析顯示，FLII敲低顯著下調了腫瘤組織中SOX2和Ki-67的表達。這些數據證明，NIBAN2顯著增強了GSC在體內的致瘤性，而FLII敲低可以部分或完全逆轉這種效應，表明FLII是NIBAN2致癌功能的關鍵下游效應器。

進一步的蛋白質組學分析表明，在NIBAN2免疫復合物中，轉錄因子RREB1在FLII富集時被高度共富集。免疫共沉淀實驗發現，NIBAN2過表達能以劑量依賴的方式顯著增強FLII與RREB1的結合，而NIBAN2敲低則導致該復合物形成減少。三元免疫共沉淀實驗表明NIBAN2可以同時結合FLII和RREB1，起到橋梁穩定作用。免疫熒光共染色顯示，在過表達NIBAN2的GSC中，FLII與RREB1的核內共定位顯著增加。鄰近連接實驗進一步證實，NIBAN2過表達顯著增加了FLII與RREB1在核內的相互作用信號。這些發現支持了NIBAN2通過促進FLII核轉位并增強其與RREB1在核內的空間相互作用來調控GSC干性程序的機制。

為確定RREB1是否是NIBAN2驅動的惡性表型的關鍵下游效應器，研究者在NIBAN2過表達的背景下敲低了RREB1。功能拮抗實驗顯示，RREB1敲低顯著削弱了GSC的腫瘤球形成能力、干細胞頻率和軟瓊脂克隆形成能力。蛋白質印跡分析證實，RREB1敲低逆轉了NIBAN2誘導的干性標志物（CD44、CD133、NANOG、Nestin）上調。在體內，與對照組相比，過表達NIBAN2顯著縮短了小鼠的中位生存期，而同時敲低RREB1則顯著延長了生存期，腫瘤體積和惡性特征也得到抑制。這些結果表明，RREB1不僅是NIBAN2介導的GSC干性表型的關鍵共調節因子，也是其體內驅動的膠質瘤進展所必需的下游效應器。

研究發現，RREB1直接結合到NIBAN2和CD44啟動子區的Ras反應元件上。染色質免疫沉淀-定量PCR分析顯示RREB1在這些位點的結合富集。RT-qPCR和蛋白質印跡分析表明，敲低RREB1下調了NIBAN2和CD44的表達，而過表達RREB1則上調了它們的表達。通過JASPAR數據庫預測并結合雙熒光素酶報告基因實驗驗證，RREB1能顯著增強NIBAN2和CD44啟動子的轉錄活性，而突變預測的結合位點則消除了這種激活。功能上，RREB1過表達促進了腫瘤球形成，而敲低NIBAN2或CD44則部分逆轉了這種干性促進作用。這表明RREB1通過直接轉錄激活NIBAN2和CD44來驅動GSC的干性程序。

RNA測序分析顯示，敲低RREB1導致糖酵解相關基因整體下調，其中LDHA下調最為顯著。京都基因與基因組百科全書通路富集分析和基因集富集分析均證實糖酵解是受RREB1調控的關鍵通路。海馬能量代謝分析表明，RREB1敲低顯著降低了GSC的基礎糖酵解速率和補償糖酵解能力。靶向代謝組學分析也顯示，RREB1敲低的細胞中葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸等關鍵糖酵解中間體顯著減少。進一步的機制研究表明，RREB1直接結合到LDHA啟動子區的RREs上，并能轉錄上調LDHA的mRNA和蛋白水平。雙熒光素酶報告實驗證實，RREB1能激活LDHA啟動子，而突變結合位點則削弱了此激活作用。綜上，RREB1通過直接轉錄激活LDHA，促進有氧糖酵解通量，從而維持GSC的代謝穩態和干性。

對118例不同級別膠質瘤臨床樣本的分析顯示，NIBAN2、FLII和RREB1在膠質母細胞瘤組織中表達一致上調，顯著高于低級別膠質瘤和正常腦組織。多重免疫熒光成像證實了這三者在GBM樣本中的共表達。分層統計分析顯示，三者高表達的頻率隨腫瘤級別升高而增加。分子亞型分析表明，該環路在MGMT啟動子非甲基化和IDH野生型患者中表達更高。組織病理學檢查發現，環路成分共表達的患者常伴隨腫瘤壞死、血管增生增加和彌漫浸潤邊緣等惡性特征。Kaplan-Meier生存分析表明，三者高表達與更短的無進展生存期和總生存期顯著相關，提示環路激活可作為不良預后的生物標志物。此外，雙通道免疫熒光顯示，NIBAN2與FLII在SOX2陽性的干細胞富集區域存在顯著的核內共定位，且RREB1核表達上調，這些標志物在空間上重疊，提供了環路協調激活的組織學證據。

通過基于結構的虛擬篩選，研究鑒定出已獲FDA批準的藥物奈非那韋（nelfinavir）是NIBAN2的高親和力結合劑。免疫共沉淀實驗驗證了奈非那韋能破壞NIBAN2-FLII復合物的相互作用。在來自高表達NIBAN2膠質瘤患者的類器官模型中，單獨使用奈非那韋或LDHA抑制劑FX11可適度降低類器官活力，而兩者聯合治療則顯示出超過80%的強烈協同毒性，并伴隨Caspase-3/7活性增加、凋亡細胞增多以及SOX2和Ki-67表達下降。在患者來源異種移植模型中，奈非那韋和FX11聯合治療顯著抑制了腫瘤生長，將腫瘤體積減少了75%以上，并將小鼠中位生存期從22天延長至45天，且不影響小鼠體重，表明良好的耐受性。免疫熒光顯示聯合治療組腫瘤中NIBAN2和LDHA表達下調，Ki-67陽性減少，TUNEL陽性細胞增多。代謝組學分析也顯示聯合治療后乳酸水平降低，細胞外酸化率顯著下降，表明糖酵解受到有效抑制。這些發現表明，靶向NIBAN2-FLII相互作用與抑制LDHA介導的糖酵解相結合，在NIBAN2高表達的膠質瘤模型中能產生強大的協同抗腫瘤效應，為針對膠質瘤代謝脆弱性的治療提供了新的轉化潛力。