《Advanced Science》：Coacervate-Mediated Lysosome-Targeting Antibody Delivery for Protein Degradation
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本研究報道了一種新型的溶酶體靶向凝聚體遞送系統（Lysosome-Sorting Peptide Coacervates， LSP-Coa），實現了抗體-膜蛋白復合物的跨膜轉運與溶酶體靶向降解。研究人員將溶酶體靶向四肽（NPGY）改造為可發生液液相分離（LLPS）的肽段衍生物，其在溶液中自組裝形成具有液體性質的微滴（凝聚體）。這些LSP-Coa能夠自發性進入細胞并定位于溶酶體，高效封裝蛋白質。當與特定抗體（如抗HER2的曲妥珠單抗、抗EGFR的西妥昔單抗）偶聯后，該系統可將抗體-膜蛋白復合物遞送至溶酶體進行降解，此機制被命名為凝聚體介導的溶酶體靶向蛋白質降解（Coacervate-mediated Lysosome-targeting Protein Degradation， CoaLPD）。研究在細胞和荷瘤小鼠模型中成功降解了HER2和EGFR，并顯示出顯著的抗腫瘤效果。此外，LSP-Coa還能通過增強細胞攝取來提高PROTAC分子的降解效率。這項工作為靶向降解傳統上“不可成藥”的膜結合蛋白提供了一種不依賴于溶酶體靶向受體（LTR）表達水平的新策略，展現出作為潛在抗癌療法的廣闊前景。
1 引言
靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation， TPD）已成為一種前景廣闊的抗癌治療策略。傳統的蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術通過小分子將靶蛋白招募至泛素-蛋白酶體系統進行降解，但對于許多膜結合的癌癥相關蛋白（Cancer-Associated Proteins， CAPs）則無能為力。為了解決這一問題，溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）技術應運而生，它利用抗體特異性識別膜蛋白，并通過與細胞表面的溶酶體靶向受體（如甘露糖-6-磷酸受體）結合，將整個復合物內吞并運往溶酶體降解。然而，這類受體依賴策略的降解效率嚴重依賴于受體在細胞表面的表達水平，存在局限性。
另一方面，液液相分離（Liquid-Liquid Phase Separation， LLPS）及其形成的分子凝聚體（coacervates）為生物大分子的跨膜遞送提供了新思路。符合“粘合劑-間隔物”（sticker-and-spacer）模型的分子可在水溶液中發生LLPS，形成微滴狀凝聚體。這些凝聚體能夠封裝各種生物制劑（如蛋白質、抗體）并將其遞送入細胞。然而，此前報道的凝聚體普遍缺乏將貨物特異性導向特定細胞器（如溶酶體）的能力。
基于此，本研究旨在填補這一空白，通過合理設計，將已知的溶酶體特異性肽段改造為既能發生相分離形成凝聚體，又能保留其溶酶體分選能力的多肽，從而開發出一種集跨膜遞送與溶酶體靶向于一體的新型遞送系統。
2 結果與討論
2.1 LSP-Coa的設計與合成
研究人員以溶酶體特異性四肽Asn-Pro-Gly-Tyr（NPGY）為基礎，在其N端引入了柔性的親水性聚乙二醇（PEG）接頭和疏水性的二苯并環辛炔（DBCO）基團作為“粘合劑”，設計并合成了多種肽段衍生物。通過篩選，他們鑒定出兩種能夠在磷酸鹽緩沖液（PBS）中形成微滴的肽段：LSP1（DBCO-PEG2-NPGY）和LSP2（DBCO-NPGY-PEG2-NPGY）。熒光顯微鏡觀察顯示，被尼羅紅染色的微滴能夠自發融合成更大的液滴。熒光漂白恢復（FRAP）實驗證實，漂白區域的熒光信號能在一分鐘內快速恢復至原強度的80%，表明這些微滴具有液體特性。通過FRAP動力學計算，LSP1和LSP2凝聚體的擴散系數分別約為2.84 × 10?2和 4.33 × 10?3μm2/s。細胞毒性實驗顯示，LSP2在1 mg/mL濃度下對SK-BR-3細胞無顯著毒性，因此被選用于后續研究，并將其形成的凝聚體命名為溶酶體分選肽凝聚體（Lysosome-Sorting Peptide Coacervates， LSP-Coa）。進一步的表征表明，LSP-Coa在PBS和含10%胎牛血清的培養基中均能保持數小時的穩定性。
2.2 細胞攝取與溶酶體靶向
研究首先證明了LSP-Coa能夠高效封裝多種熒光蛋白（封裝效率>60%）。隨后，他們探究了LSP-Coa能否將蛋白質貨物遞送入細胞并特異性靶向溶酶體。實驗比較了兩種形式的蛋白質：未經修飾的天然蛋白和與LSP肽共價偶聯的蛋白（如BSA-LSP、GFP-LSP）。共聚焦顯微鏡觀察顯示，用FAM標記的LSP2凝聚體能夠自發進入SK-BR-3細胞，并與溶酶體特異性染料LysoTracker的信號共定位，證實了LSP-Coa自身的溶酶體靶向特性。當使用LSP-Coa遞送Alexa Fluor 488標記的牛血清白蛋白（BSA-AF488）或綠色熒光蛋白（GFP）時，部分蛋白質信號與溶酶體信號重疊。而當遞送與LSP共價偶聯的蛋白質（BSA-LSP-AF488或GFP-LSP）時，貨物蛋白與溶酶體的共定位信號顯著增強，皮爾遜相關系數更高，表明LSP共價修飾能有效增強溶酶體靶向效率。進一步的機制研究表明，LSP-Coa的細胞攝取可能涉及多種途徑，其中巨胞飲作用可能扮演了重要角色。
2.3 LSP-Coa介導的表皮生長因子受體降解
接下來，研究團隊將LSP-Coa系統應用于降解人表皮生長因子受體2（HER2）。他們將抗HER2抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab， Tras）與LSP肽通過點擊化學反應偶聯，形成Tras-LSP偶聯物，然后將其與LSP肽混合形成含有Tras-LSP的凝聚體（Tras-LSP/LSP-Coa）。將這種凝聚體與SK-BR-3細胞共孵育后，Western blot分析顯示HER2蛋白水平顯著降低，且Tras-LSP/LSP-Coa的處理比僅封裝未偶聯Tras的凝聚體（Tras/LSP-Coa）具有更高的降解效率。這一全新的蛋白質降解方法被命名為凝聚體介導的溶酶體靶向蛋白質降解（Coacervate-mediated Lysosome-targeting Protein Degradation， CoaLPD）。
為了驗證CoaLPD的靶點特異性，研究人員使用抗EGFR抗體西妥昔單抗（Cetuximab， Ctx）構建了Ctx-LSP偶聯物及相應的Ctx-LSP/LSP-Coa。實驗結果表明，Tras-LSP/LSP-Coa能特異性降解HER2而對EGFR無影響，反之，Ctx-LSP/LSP-Coa能特異性降解EGFR而不影響HER2，證明了該策略具有高度的選擇性。
2.4 兩種癌癥相關蛋白的同時敲低
研究進一步證明CoaLPD策略可用于同時降解兩種CAPs（如HER2和EGFR）。他們嘗試了兩種方法：一是將Tras-LSP和Ctx-LSP與LSP肽預先混合，形成同時封裝兩種抗體的單一凝聚體（Tras-LSP/Ctx-LSP/LSP-Coa）；二是分別制備Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa，然后將兩者混合后加入細胞。Western blot結果顯示，兩種策略均能成功實現HER2和EGFR的同時降解。細胞增殖實驗表明，同時使用Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa處理細胞，對癌細胞增殖的抑制效果顯著優于使用單一抗體凝聚體，這為克服潛在的耐藥性問題提供了可能。
2.5 溶酶體降解途徑
為了闡明CoaLPD的降解機制，研究人員使用了蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑巴弗洛霉素（bafilomycin）進行干擾實驗。結果顯示，巴弗洛霉素能顯著阻斷Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa介導的HER2和EGFR降解，而MG132則沒有此效果。這與共聚焦顯微鏡下觀察到的熒光標記抗體與溶酶體的共定位現象一致，證實了CoaLPD主要通過溶酶體途徑而非泛素-蛋白酶體途徑實現靶蛋白降解。
2.6 LSP-Coa增強PROTAC的降解效率
研究還探索了LSP-Coa作為通用遞送載體，增強其他類型降解劑（如PROTAC）效力的潛力。他們以BRD4降解劑（BRD4 Degrader-5）為代表，將其與LSP-Coa共孵育后處理SK-BR-3細胞。Western blot分析表明，與單獨使用PROTAC相比，聯合使用LSP-Coa能顯著增強對BRD4長形式和短形式的降解效果。機制研究表明，LSP-Coa可能通過增強PROTAC的細胞攝取來提高其效率，但并不改變其依賴的泛素-蛋白酶體降解途徑。熒光追蹤實驗顯示，PROTAC分子先被LSP-Coa遞送至溶酶體，隨后可能逃逸至細胞質并進入細胞核發揮作用。
2.7 CoaLPD在體內的抗癌效果
最后，研究在荷瘤小鼠模型中評估了CoaLPD的抗腫瘤潛力。他們在SK-BR-3細胞建立的乳腺癌小鼠模型中，瘤內注射Tras-LSP/LSP-Coa。結果顯示，與PBS、LSP-Coa或單獨Tras處理組相比，Tras-LSP/LSP-Coa治療組的小鼠腫瘤生長受到了最顯著的抑制，腫瘤體積和重量均顯著減小，且未引起明顯的體重變化。對腫瘤組織的分析顯示，該治療組出現了大量的細胞壞死，且HER2蛋白水平最低，證明了Tras-LSP/LSP-Coa通過降解HER2在體內有效抑制了腫瘤生長。
4 結論
本研究成功地將一個溶酶體特異性四肽改造為能夠發生液液相分離、形成具有溶酶體靶向功能的肽段凝聚體（LSP-Coa）。該系統與LSP偶聯的抗體聯用，實現了一種不依賴于溶酶體靶向受體表達的高效、特異性膜蛋白降解新策略，即CoaLPD。該策略在細胞水平上展現了選擇性、高效性和多功能性（如同時降解多個靶點），并在動物模型中顯示出顯著的抗腫瘤效果。此外，LSP-Coa還能作為通用遞送平臺，增強如PROTAC等其他降解劑的效力。這項工作不僅為靶向降解膜結合蛋白這一挑戰提供了創新性解決方案，也為基于相分離和凝聚體的智能藥物遞送系統開發開辟了新道路，具有作為潛在抗癌療法的重大意義。
