骨是繼肺和肝之后第三常見(jiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移部位，骨轉(zhuǎn)移患者的中位生存期僅有1-3年，預(yù)后極差。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療，包括雙膦酸鹽等骨靶向治療聯(lián)合激素或化療，臨床效果有限。免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)療法雖然在多種惡性腫瘤中取得了革命性進(jìn)展，但在骨轉(zhuǎn)移治療中效果不佳。這一矛盾歸因于骨髓的免疫雙重性：它不僅是效應(yīng)淋巴細(xì)胞的“家園”，也富含髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)等免疫抑制細(xì)胞，形成了環(huán)繞腫瘤的“免疫屏障”，阻礙了細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移通常被視為“冷腫瘤”。

激活干擾素基因刺激因子(STING)通路被認(rèn)為是將“冷”腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤的一種策略。STING激動(dòng)劑可以觸發(fā)I型干擾素（尤其是IFNβ）的產(chǎn)生，激活抗原呈遞樹突狀細(xì)胞(DCs)，重編程免疫抑制性巨噬細(xì)胞，限制MDSCs的積累，并促進(jìn)CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞的募集與活化。然而，傳統(tǒng)的環(huán)二核苷酸(STING)激動(dòng)劑存在生物利用度差、易被酶降解等問(wèn)題。本文采用的MSA-2是一種創(chuàng)新的非核苷酸小分子STING激動(dòng)劑，在酸性腫瘤微環(huán)境中更易被細(xì)胞攝取。但MSA-2半衰期短，且據(jù)報(bào)道會(huì)上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的免疫檢查點(diǎn)分子，可能引起適應(yīng)性免疫抵抗。

B7-H3（CD276）作為B7共調(diào)節(jié)分子超家族的一員，在前列腺癌等易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的腫瘤中高表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)極低，這使其成為一個(gè)有吸引力的免疫檢查點(diǎn)靶點(diǎn)。B7-H3阻斷可以增強(qiáng)CD8⁺T細(xì)胞的功能。將STING激動(dòng)劑與ICB聯(lián)合使用已顯示出協(xié)同效應(yīng)，但系統(tǒng)性給藥STING激動(dòng)劑或ICB存在免疫相關(guān)不良事件風(fēng)險(xiǎn)，且由于骨組織獨(dú)特的血管分布，藥物在骨髓中的濃度常達(dá)不到治療水平。局部給藥為解決這些挑戰(zhàn)提供了極具前景的方案。

研究人員開發(fā)了一種可植入的雙藥儲(chǔ)庫(kù)。他們采用受控沉淀法制備了包裹B7-H3抗體的碳酸鈣(CaCO₃)微粒(αB7-H3-MPs)，平均水合動(dòng)力學(xué)直徑約為2.92 μm，zeta電位為-9.22 mV，抗體負(fù)載量約為2.48% (w/w)。隨后，將αB7-H3-MPs與STING激動(dòng)劑MSA-2共同嵌入生物相容性良好的GelMA水凝膠基質(zhì)中，經(jīng)紫外光交聯(lián)和凍干，最終形成多孔支架，最大抗壓強(qiáng)度為19.00 N，壓縮模量為5.47 MPa。

關(guān)鍵的是，該支架實(shí)現(xiàn)了pH響應(yīng)的順序釋放。在模擬生理環(huán)境的中性pH 7.4條件下，72小時(shí)內(nèi)僅釋放了約28%的αB7-H3；而在模擬腫瘤微環(huán)境的酸性pH 6.5條件下，同期釋放了約70%。相反，MSA-2的釋放是pH非依賴性的，在兩種pH下的釋放曲線幾乎重疊。因此，MSA-2會(huì)先被釋放，隨后在酸性腫瘤微環(huán)境中，CaCO₃微粒逐漸溶解，實(shí)現(xiàn)αB7-H3的后續(xù)釋放。體內(nèi)熒光成像證實(shí)，負(fù)載了BSA-FITC-MPs和DiL（分別模擬αB7-H3和MSA-2）的支架能在植入部位維持至少14天的強(qiáng)熒光信號(hào)，而游離藥物則在7天內(nèi)迅速清除，證明了支架的持續(xù)局部藥物釋放能力。

體外實(shí)驗(yàn)深入闡明了該支架的作用機(jī)制。研究首先考察了支架釋放的藥物對(duì)免疫抑制性細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。用支架釋放的條件培養(yǎng)基處理MDSCs和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMs)發(fā)現(xiàn)，特別是來(lái)自雙載藥支架的培養(yǎng)基，能顯著降低MDSCs中免疫抑制酶精氨酸酶1(Arg1)和一氧化氮合酶(Nos2)的mRNA水平，同時(shí)顯著增加干擾素β1(Ifnb1)的表達(dá)。Western blot分析證實(shí)，MSA-2處理顯著上調(diào)了MDSCs和BMDMs中磷酸化STING(p-STING)及其下游磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(p-IRF3)的水平，表明STING通路被成功激活。

然而，MSA-2處理也誘導(dǎo)了MDSCs、BMDMs以及腫瘤細(xì)胞（如骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系Myc-Cap）中B7-H3蛋白的表達(dá)上調(diào)，這與先前報(bào)道一致，表明STING活化可能伴隨檢查點(diǎn)分子的上調(diào)，從而限制療效。功能實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)MSA-2預(yù)處理的MDSCs對(duì)CD8⁺T細(xì)胞增殖的抑制能力被部分解除，而經(jīng)雙藥支架條件培養(yǎng)基預(yù)處理的MDSCs，其抑制效應(yīng)幾乎被完全消除，CD8⁺T細(xì)胞增殖得以近乎完全恢復(fù)。同樣，MSA-2處理能驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞從M2樣（免疫抑制）表型向M1樣（促炎、殺傷腫瘤）表型極化，而αB7-H3的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了這種極化。

在模擬腫瘤微環(huán)境的Myc-Cap細(xì)胞、MDSCs和BMDMs共培養(yǎng)體系中，MSA-2處理顯著上調(diào)了三種細(xì)胞表面的B7-H3表達(dá)。當(dāng)加入CD8⁺T細(xì)胞后，MSA-2預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于未處理對(duì)照組，而αB7-H3的共存進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞凋亡。T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，僅用MSA-2預(yù)處理部分恢復(fù)了T細(xì)胞增殖，而用雙藥支架條件培養(yǎng)基預(yù)處理幾乎完全逆轉(zhuǎn)了T細(xì)胞增殖抑制，CD8⁺T細(xì)胞大量增殖。+ T細(xì)胞增殖情況。">

這些結(jié)果表明，MSA-2能有效激活STING通路，將免疫抑制的腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷睜顟B(tài)，但同時(shí)會(huì)上調(diào)B7-H3；而B7-H3阻斷則能解除由此產(chǎn)生的免疫抑制，兩者協(xié)同顯著增強(qiáng)CD8⁺T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒功能，導(dǎo)致更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷。

研究人員在FVB小鼠中建立了骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌(bmPCa)模型，模擬手術(shù)切除（切除約90%腫瘤）后植入支架的治療場(chǎng)景。在術(shù)后第5天，通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)(CyTOF)分析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，支架治療組小鼠骨髓腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞景觀發(fā)生了顯著改變。特別值得注意的是，治療組中與免疫抑制相關(guān)的CD14⁺MDSCs亞群比例和CD14表達(dá)水平均降低。同時(shí)，巨噬細(xì)胞向M1表型極化增加，M2表型減少，M1/M2比值顯著升高。效應(yīng)細(xì)胞方面，治療組腫瘤中的CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)更高水平的IFNγ、TNFα和顆粒酶B(GzmB)，表明其細(xì)胞毒性功能增強(qiáng)。此外，NK細(xì)胞中GzmB、TNFα和IFNγ的表達(dá)也有升高趨勢(shì)，樹突狀細(xì)胞(DCs)上調(diào)了共刺激成熟標(biāo)志物CD86，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例則顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，支架治療迅速將骨髓腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)重塑為免疫激活狀態(tài)。+ T細(xì)胞功能分子的變化。">

在長(zhǎng)期療效實(shí)驗(yàn)中，小鼠被分為七組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，僅手術(shù)的對(duì)照組和空白支架組腫瘤迅速?gòu)?fù)發(fā)。單次注射游離MSA-2和αB7-H3僅能輕微延緩腫瘤生長(zhǎng)。而采用順序釋放設(shè)計(jì)的雙藥支架(G7：scaffold^MSA-2_αB7-H3-MP)療效最佳，在21天觀察期內(nèi)幾乎完全抑制了腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤抑制率接近100%，且所有小鼠在60天觀察期內(nèi)均存活。相比之下，釋放順序相反的支架(G6：scaffold ^αB7-H3_MSA-2-MP)療效則顯著降低（抑制率為93.3%），凸顯了順序釋放策略的重要性。微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)顯示，G7組小鼠脛骨保持了更正常的骨結(jié)構(gòu)，骨表面更光滑。組織學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)，G7組僅殘留微小腫瘤，腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67陽(yáng)性細(xì)胞極少，而凋亡細(xì)胞(TUNEL⁺)比例最高。

為了評(píng)估支架治療能否誘導(dǎo)長(zhǎng)效免疫保護(hù)，研究人員對(duì)經(jīng)支架治療獲得完全緩解的小鼠進(jìn)行了腫瘤再攻擊實(shí)驗(yàn)。將Myc-Cap細(xì)胞注射到對(duì)側(cè)（未經(jīng)治療的）脛骨中。結(jié)果顯示，預(yù)先接受支架治療的小鼠對(duì)再攻擊表現(xiàn)出強(qiáng)大的抵抗力，其腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)遠(yuǎn)低于初次接種的對(duì)照小鼠，所有治療組小鼠均在觀察期內(nèi)存活。機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，這些小鼠的脾臟中記憶T細(xì)胞（包括中央記憶T細(xì)胞T_CM和效應(yīng)記憶T細(xì)胞T_EM）比例顯著升高，成熟的DCs（CD80⁺CD86⁺）和MHCII⁺DCs的比例也更高，表明產(chǎn)生了系統(tǒng)性的免疫記憶。

研究進(jìn)一步在4T1（乳腺癌）和LLC（肺癌）骨轉(zhuǎn)移模型中驗(yàn)證了支架的普適性。在這兩種同樣高表達(dá)B7-H3的模型中，scaffold^MSA-2_αB7-H3-MP均表現(xiàn)出卓越的治療效果，顯著抑制了腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展，保護(hù)了骨骼結(jié)構(gòu)，減少了腫瘤負(fù)荷。

本研究針對(duì)骨轉(zhuǎn)移免疫抑制微環(huán)境和現(xiàn)有ICB療法療效有限的挑戰(zhàn)，設(shè)計(jì)了一種創(chuàng)新的局部免疫治療策略。骨髓作為關(guān)鍵的免疫器官，其微環(huán)境中富含MDSCs和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，使得骨轉(zhuǎn)移成為典型的“冷腫瘤”。激活STING通路是將其轉(zhuǎn)化為“熱腫瘤”的關(guān)鍵，但STING的全身性激活可能引發(fā)毒性，且單次給藥難以維持持久免疫反應(yīng)。本工作設(shè)計(jì)的GelMA支架實(shí)現(xiàn)了STING激動(dòng)劑MSA-2的局部、緩釋遞送，在確保安全性的同時(shí)，有效激活了STING-IFNβ信號(hào)。

值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)STING激活會(huì)同時(shí)上調(diào)B7-H3這一免疫檢查點(diǎn)分子，這可能是限制STING激動(dòng)劑療效的一個(gè)機(jī)制。因此，將STING激活與B7-H3阻斷相結(jié)合具有強(qiáng)力的協(xié)同理論依據(jù)。本研究的關(guān)鍵創(chuàng)新在于采用了順序釋放策略：先釋放MSA-2激活免疫應(yīng)答并上調(diào)B7-H3，隨后在酸性腫瘤微環(huán)境中釋放αB7-H3抗體以阻斷該檢查點(diǎn)，防止T細(xì)胞耗竭。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，特別是反向順序釋放對(duì)照組療效較差的結(jié)果，有力證明了這種時(shí)序設(shè)計(jì)的重要性。

綜上所述，本研究成功開發(fā)了一種可植入的、順序釋放STING激動(dòng)劑MSA-2和B7-H3抗體的GelMA支架。該支架通過(guò)在術(shù)后腫瘤切除部位提供局部、持續(xù)的免疫調(diào)節(jié)藥物釋放，有效重編程了骨轉(zhuǎn)移的免疫抑制微環(huán)境，減少了免疫抑制細(xì)胞（如MDSCs和M2巨噬細(xì)胞），增強(qiáng)了效應(yīng)免疫細(xì)胞（如M1巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞）的功能，從而在多種骨轉(zhuǎn)移模型中實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)大的腫瘤抑制、防止術(shù)后復(fù)發(fā)并誘導(dǎo)了持久的保護(hù)性免疫。這一策略為治療骨轉(zhuǎn)移提供了一種有前景且易于轉(zhuǎn)化的局部免疫治療新方法。