《Journal of Genetics and Genomics》：Mitochondrial genome editing tools: prospects in animal breeding
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線粒體基因組編輯技術為動物育種提供新途徑，涉及CRISPR-free蛋白編輯系統開發、突變體動物模型構建及經濟性狀關聯研究，需解決編輯精度與安全倫理問題。
徐巖|陳明月|楊順凱|郭玉陽|戴一超|陳玉彤|鐘海江|馬泰森|查定瑞|何玉濤|李白宇|賈新宇|郭龍|胡建紅|魏英輝|陳曉旭
西北農林科技大學動物科學與技術學院，中國陜西省楊陵市新農路22號，712100
摘要
線粒體是負責驅動細胞能量代謝和調節關鍵生物過程的重要細胞器。它們的環狀線粒體DNA（mtDNA）編碼呼吸鏈蛋白的13個亞基，但由于高水平的活性氧和有限的修復機制，容易發生突變。只有當異質性超過某個臨界閾值時，突變表型才會顯現出來。長期以來，由于缺乏精確的編輯工具，人們對mtDNA突變的后果了解甚少。最近，無需CRISPR技術的、僅基于蛋白質的線粒體堿基編輯器實現了C·G到T·A和A·T到G·C的轉換。這些突破為創建相關疾病模型提供了便利，并為動物育種帶來了獨特的機會，因為已知特定的mtDNA變異會影響家畜的生產力、繁殖能力和抗逆性等經濟重要性狀。本文總結了線粒體基因組編輯技術的最新進展，包括基于CRISPR/Cas的系統、限制性內切酶、雙鏈DNA脫氨酶毒素A（DddA）為基礎的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，以及無需DddA的堿基編輯器，同時還探討了它們的遞送策略和優化方法。此外，我們還概述了mtDNA多態性、拷貝數變異與家畜和家禽經濟性狀之間的關聯。最后，我們討論了線粒體基因組編輯在動物育種中的潛在應用，并強調了需要密切關注的安全性和倫理問題。
引言
線粒體是重要的半自主細胞器，是進行有氧呼吸的主要場所，包括三羧酸（TCA）循環和氧化磷酸化（OXPHOS）（Anderson等人，1981年）。除了在ATP合成中的經典作用外，線粒體還參與多種細胞過程，如維持細胞內外Ca2+的穩態、氧化還原信號傳導以及凋亡的調節（Brenner和Mak，2009年；Fan等人，2020年；Picard和Shirihai，2022年）。與核基因組不同，線粒體擁有自己的環狀DNA（mtDNA），該DNA編碼位于線粒體內膜內的呼吸鏈復合體的13個蛋白質亞基，以及22個轉運RNA（tRNA）和2個核糖體RNA（rRNA）基因（具體為12S rRNA和16S rRNA）（Anderson等人，1981年）。由于線粒體靠近高濃度的活性氧（ROS），缺乏保護性組蛋白，且DNA修復機制不足，mtDNA極易發生遺傳變異（Volobueva等人，2018年）。因此，mtDNA的突變率估計大約是核DNA的20倍（árnadóttir等人，2024年）。重要的是，線粒體突變的功能后果不僅取決于其是否存在，還取決于突變mtDNA的相對豐度，因為每個細胞含有多個mtDNA拷貝（Wiesner等人，1992年）。因此，細胞通常包含野生型和突變型基因組的混合物，這種狀態稱為異質性（Yan等人，2019年）。只有當突變基因組的比例超過某個臨界閾值（通常超過75%）時，才會出現突變表型，此時線粒體功能會受損（Wallace，2018年）（圖1A）。
盡管在普通人群中mtDNA突變的發病率相對較低，估計在人類中約為1/5000，但這些突變經常導致明顯的表型，通常涉及嚴重的代謝或神經肌肉功能障礙（Gorman等人，2015年）。這些表型結果的機制基礎仍然知之甚少，主要是由于缺乏可靠的、精確的mtDNA突變模型（Wallace，2010年）。該領域的一個關鍵瓶頸是開發能夠引入定義性突變的線粒體基因組編輯工具，以便在生理相關系統中進行功能分析（Phan等人，2023年）。雖然基于RNA的核編輯工具，如CRISPR/Cas9系統、prime editor（PE）、tandem interspaced guide RNA/TIGR-associated protein系統（TIGR/Tas）和site-specific target-primed insertion through targeted CRISPR homing of retroelements（STITCHR），已經徹底改變了核基因組的操作（Cong等人，2013年；Chen等人，2021年；Faure等人，2025年；Fell等人，2025年），但它們在線粒體中的應用受到限制。這一限制源于兩個主要障礙：缺乏有效的線粒體RNA導入方法，以及核與線粒體之間DNA修復途徑的根本差異（Gammage等人，2018年）。值得注意的是，線粒體缺乏典型的雙鏈斷裂（DSB）修復途徑。這一特性使得基于核酸酶的策略僅適用于選擇性消除突變mtDNA，而不適合引入或模擬特定變異（Fontana和Gahlon，2020年）。因此，這些方法無法引入或模擬精確的mtDNA突變，從而限制了它們在機制研究和疾病建模中的應用（Gammage等人，2018年）。為了克服這些挑戰，最近開發的無需CRISPR的線粒體堿基編輯器實現了高效的C·G到T·A和A·T到G·C轉換，而不會引起雙鏈斷裂（DSBs）（Mok等人，2020年；Cho等人，2022年；Hu等人，2024年；Yi等人，2024a）。這些工具已成功用于生成線粒體疾病的動物模型，包括斑馬魚（Bian等人，2019年；Guo等人，2021年；Sabharwal等人，2021年）、小鼠（Guo等人，2022年；Willis等人，2022年；Zhang等人，2025年）和大鼠（Qi等人，2021年，2023年；Chen等人，2025a，2025b），從而為解析疾病機制和評估治療策略提供了途徑。
基于在線粒體人類疾病模型中的成功應用，人們越來越感興趣將這些技術應用于動物育種。mtDNA通過卵細胞質母系遺傳，并在世代間穩定傳遞（Giles等人，1980年）。其嚴格的單親遺傳特性和在生物能量學中的核心作用使mtDNA成為遺傳評估、系統發育重建和種群譜系追蹤中廣泛使用的標記物（Elyasigorji等人，2023年；Agbani等人，2025年；Colombo等人，2025年）。最近的研究發現了與家畜和水產養殖物種經濟重要性狀相關的線粒體遺傳變異（Jain等人，2024年）。這些發現突顯了mtDNA編輯作為精準育種和性狀改良的補充策略的潛力。然而，mtDNA編輯在農業物種中的應用仍受到若干技術挑戰的制約（Phan等人，2023年）。本文總結了線粒體基因組編輯工具的開發和改進的最新進展，并探討了它們在動物育種計劃中的轉化潛力，重點關注mtDNA多態性、拷貝數變異及其與經濟相關性狀的關聯。
章節片段
基于CRISPR/Cas的嘗試
最初將基因組編輯工具應用于線粒體的努力主要集中在CRISPR/Cas系統上（Jo等人，2015年；Bian等人，2019年；Hussain等人，2021年；Bi等人，2022年；Chang等人，2023年；Norota等人，2025年）。該系統利用單導向RNA（sgRNA）將Cas核酸酶引導至特定DNA序列，產生雙鏈斷裂（DSBs），從而激活細胞修復機制以實現基因破壞或靶向整合（Cong等人，2013年）。
結論
線粒體基因編輯技術雖然主要用于線粒體疾病研究，但也為動物育種提供了獨特的機會。正如本文所討論的，DdCBE、TALEDs和mitoBE等工具能夠更精確地靶向mtDNA，并逐步解決了遞送、編輯效率、脫靶效應和序列特異性等相關問題。然而，仍存在一些挑戰，包括：（1）縮小編輯窗口；（2）提高...
未引用的參考文獻
Gaj等人，2023年；Huang等人，2024年；Zhang等人，2021年。致謝
本工作得到了國家自然科學基金（82302099資助X.C.；32441080和32301251資助Y.W.）和陜西省重點研發計劃（2025NC-YBXM-109資助Y.W.）的支持。
