《Journal of Physiology》：The sympathoregulatory region of the mouse rostral brainstem relies on both GABA and glycine to generate inhibitory currents
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本文通過電生理、神經解剖和病毒示蹤技術，系統揭示了小鼠腹外側和腹內側延髓（VLM/VMM）的交感前神經元不僅接受GABA能抑制，還接收來自甘氨酸能神經元（以甘氨酸轉運體2（GlyT2）為標記）的單突觸輸入，且該輸入同時釋放GABA與甘氨酸兩種抑制性神經遞質。研究進一步發現，增強網絡活動可促進甘氨酸釋放，而持續的甘氨酸釋放依賴于GlyT2介導的再攝取。此外，研究明確了腹側腦干中GlyT2表達神經元的定位，并證實VLM/VMM神經元表達甘氨酸受體（GlyR）的α1、α3與β亞基。這些發現強調了在交感神經活動調控中，GABA能與甘氨酸能抑制共同作用的必要性，為理解相關神經環路提供了新的視角。
引言：腦干頭端的雙重抑制調控
在中樞神經系統中，γ-氨基丁酸（GABA）與甘氨酸（Glycine）是主要的抑制性神經遞質。它們通過作用于離子型受體（氯離子通道），導致神經元超極化，從而抑制其活動。越來越多的證據表明，在脊髓、背側耳蝸核、外展核以及延髓腹外側/腹內側區（VLM/VMM）等多個腦區，GABA與甘氨酸存在共釋放現象。位于腹側腦干的交感前神經元是調控交感神經活動的關鍵中繼站，它們接收來自高級腦區的下行輸入，并將信息傳遞給脊髓的交感節前神經元。以往的研究主要強調了GABA能抑制在VLM/VMM交感前神經元中的主導作用，而甘氨酸能輸入的具體來源、釋放機制及其功能意義尚不明確。
方法：綜合技術揭示神經連接與功能
為了探究上述問題，研究團隊運用了多學科技術組合。首先，他們構建了GlyT2Cre小鼠，并將其與表達光敏感通道蛋白2（ChR2）的小鼠雜交，獲得了GlyT2ChR2/EYFP小鼠模型。這使得研究人員能夠通過光刺激選擇性激活表達GlyT2的神經纖維。同時，為了特異性標記VLM/VMM中的交感前神經元，研究人員向小鼠左腎注射了逆行轉運的偽狂犬病毒（PRV-614）。在腦片制備中，對PRV標記的神經元進行了全細胞膜片鉗記錄，以分析其抑制性突觸后電流（IPSCs）。此外，研究還結合了單突觸和跨突觸病毒示蹤技術來確定甘氨酸能神經元的位置，并采用免疫熒光染色檢測了VLM/VMM神經元中甘氨酸受體不同亞基的表達。
結果一：自發性抑制性電流由GABA與甘氨酸共同介導
對PRV標記的交感前神經元的電生理記錄顯示，其自發性抑制性突觸后電流（sIPSCs）在應用GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿（Bicuculline）后，頻率和平均相位電流（Iphasic）均顯著下降，表明約40%的抑制性電流由GABA介導。剩余的約60%的sIPSCs對荷包牡丹堿不敏感，但可被甘氨酸受體拮抗劑士的寧（Strychnine）完全阻斷，證實了甘氨酸能電流的存在。
有趣的是，當使用鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶（4-AP）增強整體網絡興奮性時，即使在荷包牡丹堿存在的情況下，甘氨酸能sIPSCs的頻率和幅度也大幅增加。這表明增強的神經元活動能夠促進甘氨酸的釋放。
結果二：光刺激甘氨酸能纖維觸發GABA與甘氨酸共釋放
為了直接研究甘氨酸能輸入，研究人員對GlyT2ChR2/EYFP小鼠VLM/VMM腦片中的GlyT2表達纖維進行光刺激。結果顯示，光刺激在67%的記錄神經元中誘發了抑制性突觸后電流（eIPSCs）。應用荷包牡丹堿可部分降低eIPSCs的幅度和電荷轉移量，而隨后聯用荷包牡丹堿與GlyT2選擇性抑制劑ORG25543則進一步降低了反應幅度。最終，士的寧完全阻斷了剩余的eIPSCs。這一系列藥理學實驗證明，光刺激誘發的電流是由GABA和甘氨酸共同釋放產生的，并且GlyT2介導的甘氨酸再攝取對于維持甘氨酸能神經傳遞至關重要。
結果三：證實單突觸連接與短時程可塑性
通過應用河豚毒素（TTX）阻斷電壓門控鈉通道，光誘發的eIPSCs被取消；而隨后聯用TTX和4-AP則部分恢復了eIPSCs，并伴有反應延遲的增加。這一經典實驗證實了GlyT2表達神經元與交感前VLM/VMM神經元之間存在直接的、單突觸連接。
此外，研究還探討了甘氨酸能突觸的短時程可塑性。對GlyT2纖維進行連續光刺激（脈沖間隔50毫秒）時，觀察到了明顯的突觸抑制，表現為后續脈沖誘發的電流幅度相對于第一個脈沖大幅下降。當脈沖間隔延長至2000毫秒時，這種抑制基本消失。重要的是，在單獨使用荷包牡丹堿或ORG25543時，配對脈沖比率（PPR）未發生改變；然而，在荷包牡丹堿存在的情況下再應用ORG25543（即特異性抑制甘氨酸再攝取），則顯著降低了PPR。這表明GlyT2的功能對于維持高頻刺激下甘氨酸的持續性釋放至關重要。
結果四：定位甘氨酸能神經元并鑒定甘氨酸受體亞基
通過向GlyT2Cre小鼠VLM區注射Cre依賴的逆行AAV病毒（pAAV-hSyn-DIO-EGFP），研究人員在腹側腦干，特別是外側旁巨細胞核和B?tzinger復合體區域，觀察到了大量表達綠色熒光蛋白（EGFP）的甘氨酸能神經元胞體。將此項技術與腎注射PRV-614相結合，還發現了一些同時表達EGFP（甘氨酸能）和紅色熒光蛋白（RFP，交感前）的雙標神經元，進一步支持了局部甘氨酸能神經元對交感前神經元的投射。
免疫熒光染色結果顯示，VLM/VMM區域的交感前神經元表達甘氨酸受體的α1、α3和β亞基。其中，α1亞基的免疫反應陽性點狀信號廣泛分布在神經元的樹突區域，而α3亞基的免疫反應則更多集中在神經元胞體，提示這兩種亞基在細胞上的分布可能存在功能分區。
討論：雙重抑制的生理意義與未來展望
本研究系統地證實了小鼠腹側腦干中，表達GlyT2的神經元依賴GABAA受體和甘氨酸受體共同產生抑制性突觸后電流。這些神經元直接向交感前VLM/VMM神經元提供單突觸輸入，并同時釋放GABA和甘氨酸兩種遞質。甘氨酸的釋放可隨網絡活動增強而增加，且其持續性釋放嚴格依賴于GlyT2轉運體對甘氨酸的再攝取回收。
這一發現具有重要的生理意義。在聽覺腦干核等區域，GABA和甘氨酸的共釋放被認為可以精細調節抑制的強度與時間特性。在本研究關注的交感神經調控環路中，雙重抑制可能發揮著類似的作用：GABA可能負責設定神經元的興奮性閾值，而甘氨酸則在突觸活動增強時提供更強的抑制效能。此前在大鼠模型中的研究也提示，阻斷甘氨酸受體會縮短壓力反射介導的交感抑制時間過程，支持了這一假設。
總之，該研究不僅揭示了VLM/VMM區存在此前被低估的甘氨酸能抑制，更重要的是闡明了這種抑制與GABA能抑制交織共存的復雜圖景。它強調在未來探討交感神經輸出的調控機制時，必須同時考量GABA能和甘氨酸能兩種抑制性神經傳遞的作用。對相關神經環路和甘氨酸受體亞基功能的深入理解，可能為與交感神經活動異常相關的心血管疾病、呼吸障礙等疾病的機制研究與干預提供新的思路。
