蜜蜂對全球經(jīng)濟至關(guān)重要，不僅是蜂蜜的主要來源，還是農(nóng)業(yè)和園藝中的關(guān)鍵授粉者（Forsgren, 2010; Genersch, 2010）。然而，由于細菌、病毒、原生動物、真菌和寄生螨蟲等多種病原體的影響，蜜蜂種群數(shù)量一直在下降（Forsgren, 2010）。其中，Melissococcus plutonius是導(dǎo)致歐洲幼蟲腐臭病（EFB）的病原體，被認為是最具經(jīng)濟危害性的病原體之一，并與蜂蜜產(chǎn)量減少有關(guān)。

M. plutonius是一種需氧或厭氧環(huán)境下生長、且需要較高二氧化碳濃度的革蘭氏陽性細菌。它是歐洲幼蟲腐臭病（EFB）的主要原因，這種疾病嚴重影響西方蜜蜂（Apis mellifera）的幼蟲（Arai et al., 2012）。該細菌已在墨西哥（de León-Door et al., 2018）、美國（Fowler et al., 2025）、瑞士（Belloy et al., 2007）、中國（Arai et al., 2012, Cai et al., 2025, Fowler et al., 2025）、韓國（Truong et al., 2023）和日本（Arai et al., 2012）等多個國家的蜜蜂種群中造成嚴重危害。M. plutonius會侵染幼蟲的中腸，破壞營養(yǎng)吸收并導(dǎo)致幼蟲死亡（Forsgren, 2010）。由于M. plutonius導(dǎo)致的幼蟲存活率下降，蜂蜜、蜂蠟和蜂王漿的產(chǎn)量大幅減少，同時影響農(nóng)業(yè)所需的授粉服務(wù)（Takamatsu et al., 2017, Budge et al., 2014）。隨著世界對授粉和蜂產(chǎn)品依賴度的增加，有效控制這一病原體對于保護蜜蜂健康和維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定至關(guān)重要。

準確快速地檢測M. plutonius對于有效管理EFB至關(guān)重要。傳統(tǒng)方法（如從受感染幼蟲或蜂巢樣本中培養(yǎng)細菌）速度慢、勞動強度高且操作困難，因為該病原體在實驗室條件下的生長能力較弱（Forsgren, 2010, Arai et al., 2012）。基于PCR的檢測方法雖然靈敏度和特異性較高，但需要專用設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，限制了其在實際應(yīng)用中的使用（Nesvorna et al., 2020）。血清學方法往往無法實現(xiàn)早期診斷（Fierz, 2024）。為克服這些限制，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增-側(cè)向流動試紙條（LAMP-LFD）檢測方法應(yīng)運而生，成為一種實用的分子檢測手段。

LAMP-LFD是一種簡單可靠的細菌、病毒和寄生蟲檢測工具。由于LAMP在恒定溫度下進行擴增，無需復(fù)雜設(shè)備，因此比傳統(tǒng)PCR更具實用性（Notomi et al., 2000, Mori and Notomi, 2009）。此前已有多項研究利用LAMP檢測多種蜜蜂病原體，如M. plutonius（Nguyen et al., 2012, Chupia et al., 2016, Kato et al., 2020, Ackerly et al., 2024, Lannutti et al., 2025）、Paenibacillus larvae（Ackerly et al., 2024）、Nosema apis（Lannutti et al., 2025）、Nosema ceranae（Lannutti et al., 2025, Chupia et al., 2016）以及微孢子蟲（Lannutti et al., 2025, Kato et al., 2020）。當LAMP與側(cè)向流動試紙條結(jié)合使用時，其特異性更高，能夠區(qū)分真陽性與假陽性（非特異性擴增產(chǎn)物），結(jié)果易于肉眼觀察，適用于現(xiàn)場檢測（Rolando et al., 2020, Buddhachat et al., 2024, Zhang et al., 2025）。因此，LAMP-LFD越來越多地被用于建立即時檢測系統(tǒng)，例如檢測食品樣本中的大腸桿菌（Cui et al., 2024）和沙門氏菌（Yang et al., 2018）、臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌（Kaewphinit et al., 2013）、流感A病毒（H1N1）和呼吸道合胞病毒（RSV）（Zhang et al., 2025）、水稻中的黃單胞菌 pv. oryzae（Xoo）和黃單胞菌 pv. oryzicola（Xoc）（Buddhachat et al., 2024），以及水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的海鏈球菌（Wang et al., 2023）。

本研究旨在建立一種結(jié)合比色環(huán)介導(dǎo)等溫擴增與側(cè)向流動試紙條的檢測方法（cLAMP-LFD），用于高效檢測蜜蜂中的M. plutonius>，以構(gòu)建實用的現(xiàn)場診斷系統(tǒng)。我們堅信LAMP-LFD可通過早期檢測幫助改善EFB的管理，從而減少經(jīng)濟損失并保護蜜蜂種群。

為了獲得最佳的LAMP擴增條件，我們使用不同的引物（gyrB1、gyrB2和sodA）測試了多種溫度和孵育時間。結(jié)果表明，所有引物組合在60°C和63°C下均能產(chǎn)生梯狀條帶圖案，而使用gyrB2的LAMP在65°C時也能產(chǎn)生梯狀條帶圖案（圖3A）。不過，所有引物組合的LAMP產(chǎn)物在63°C時的強度最為明顯。

M. plutonius作為EFB的致病菌，已在全球范圍內(nèi)造成嚴重的蜂蜜產(chǎn)量損失（Arai et al., 2012, Budge et al., 2014, Takamatsu et al., 2014, Mallory et al., 2024）。現(xiàn)有的檢測方法（如顯微鏡觀察、培養(yǎng)、掃描電子顯微鏡觀察、ELISA和PCR）通常靈敏度較低且操作復(fù)雜（Forsgren, 2010, Arai et al., 2012, Nesvorna et al., 2020; Fierz, 2024; Budge et al., 2024）。本研究開發(fā)了LAMP-LFD方法，以便在現(xiàn)場快速檢測M. plutonius

我們成功開發(fā)了一種基于gyrB1的快速、靈敏且特異性的LAMP-LFD檢測方法，可用于檢測蜜蜂幼蟲和蜂蜜樣本中的M. plutonius>。該方法無需DNA提取，檢測限分別為每反應(yīng)11.4 CFU（幼蟲）和80 CFU（蜂蜜），檢測時間僅需1小時，非常適合現(xiàn)場診斷。盡管該方法無法區(qū)分典型的和非典型的M. plutonius菌株，但仍能提供有力的檢測結(jié)果。

在準備本手稿期間，作者使用ChatGPT輔助英文編輯以提高可讀性。隨后，作者對內(nèi)容進行了全面審查和修改，并對最終出版物承擔全部責任。

Fierz, 2004; Habib et al., 2024; Lannutti et al., 2022; Mallepaddi et al., 2018; Njiru, 2012; Parida et al., 2008; Prompamorn et al., 2011; Srimongkol et al., 2020; Tran et al., 2021.

作者聲明沒有可能影響本文研究結(jié)果的已知財務(wù)利益或個人關(guān)系。

本研究得到了泰國納瑞蘇安大學（Naresuan University）的資助（項目編號：R2569C038）和泰國納瑞蘇安大學的“全球與前沿研究大學基金”（項目編號：R2566C051）的支持。此外，還得到了“湄公河-韓國合作基金”（MKCF，項目編號：C8-THA01）的資助（該基金隸屬于湄公河研究所（Mekong Institute）。