在追求健康與可持續的飲食潮流中，植物蛋白正成為食品工業的明星原料。其中，燕麥蛋白因其均衡的氨基酸組成、低致敏性以及對麩質不耐受人群的友好特性而備受關注。將植物蛋白制成凝膠，是開發人造肉、冷凍面團、酸奶和冷凍甜品等植物基替代食品，以及構建活性物質（如姜黃素、酚類化合物）遞送系統的關鍵技術。然而，一個棘手的現實問題橫亙在面前：許多蛋白基凝膠食品在冷凍、儲藏和解凍過程中，其凝膠性能會出現顯著惡化，表現為結構收縮、脫水析水、硬度增加等不良質地變化，嚴重影響最終產品的品質。例如，豆腐經歷凍融循環后持水力下降，硬度與彈性卻增加；大豆蛋白凝膠在凍融處理后，會通過疏水相互作用和二硫鍵形成導致分子聚集，產生僵硬的蛋白聚集體。因此，提升植物蛋白凝膠的凍融穩定性，已成為冷凍食品行業一項緊迫的技術挑戰。

燕麥作為一種典型的耐寒作物，其蛋白質（主要為球蛋白）相比大豆和豌豆蛋白具有更優的熱穩定性。這種天生的對高低溫條件的結構適應性，暗示著燕麥蛋白分離物在開發具有增強凍融穩定性的蛋白凝膠系統方面潛力巨大，但相關系統研究卻十分有限。蛋白質凝膠的形成高度依賴于環境因素，其中pH值和成膠機制（如熱誘導、酶交聯）是關鍵調控手段。pH調節、熱處理和酶促交聯各自都能誘導蛋白質的結構與功能改變，但不同成膠方法在 varying pH條件下對燕麥蛋白分離物凝膠凍融穩定性的聯合效應，此前尚不明確。

為了填補這一知識空白，并闡明pH、成膠機制與凍融穩定性之間的內在關系，本研究聚焦于燕麥蛋白分離物，系統比較了在不同pH條件(5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0)下，通過兩種成膠機制（熱誘導與轉谷氨酰胺酶(TGase)誘導）形成的燕麥蛋白分離物凝膠的結構特性與凍融穩定性。該研究旨在闡明環境控制參數對燕麥蛋白分離物凝膠系統功能特性的影響規律，從而為面向冷凍食品應用的燕麥蛋白分離物基凝膠產品的定向設計與高值化開發提供理論基礎。本研究成果發表于《LWT》期刊。

研究人員開展本研究主要運用了以下關鍵技術方法：通過堿溶酸沉法從燕麥粉中提取并制備了燕麥蛋白分離物(OPI)。分別采用熱誘導（95°C水浴加熱80分鐘）和TGase酶誘導（55°C水浴孵育3小時）兩種方法，在五個不同pH值(5.0-9.0)下制備OPI凝膠樣品。對所有凝膠樣品進行多次（最多5次）凍融循環處理（-20°C冷凍22小時，25°C水浴解凍4小時為一個循環）。利用質構分析儀測定凝膠強度，色差儀測定顏色參數(L, a, b*)。通過掃描電子顯微鏡(SEM)和激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)觀察凝膠的微觀形貌與三維網絡結構。采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析蛋白質二級結構組成（α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲）。通過內源熒光光譜和紫外光譜分析蛋白質三級構象變化。使用ANS熒光探針法測定表面疏水性(H₀)。通過化學試劑選擇性溶解法，定量分析凝膠中的分子間作用力（離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵）。

研究發現，凍融處理會導致凝膠結構劣化，但也能通過凍融濃縮效應增強蛋白質-蛋白質相互作用，從而普遍提高凝膠強度（除pH 5.0樣品外）。在pH 6.0時兩種凝膠的強度均較高，但其宏觀結構粗糙，這是因為pH接近燕麥蛋白的等電點(pI≈4.5)，形成了大量不溶性聚集體作為填充物。總體而言，pH 6-9的凝膠強度高于pH 5.0的凝膠。比較而言，TGase誘導的凝膠在pH 9.0時強度高于熱誘導凝膠，后者在pH 9.0時僅表現為高粘度流體狀，表明pH調節結合TGase交聯能有效增強OPI凝膠強度。

pH和成膠方法顯著影響凝膠的顏色特性。隨著pH從酸性增至堿性，凝膠在外觀上從不透明的白色顆粒形態逐漸轉變為更半透明的褐色鏈狀結構。堿性條件下更高的光反射率和更穩定的網絡結構導致了顏色上的變化。

SEM和CLSM觀察直觀揭示了凍融循環導致的凝膠網絡結構惡化，表現為孔洞增大、裂紋出現。比較發現，在pH 8.0-9.0下形成的凝膠，尤其是TGase誘導的凝膠，在經過5次凍融循環后保持了更優的結構完整性。pH通過影響蛋白質表面電荷(α)來調控分子間靜電斥力，從而改變蛋白質聚集行為：遠離等電點時，靜電斥力增強，抑制分子聚集，有利于通過分子間交聯形成精細的鏈狀凝膠網絡；而接近等電點時，靜電斥力最小，促進強烈的分子聚集，形成粗糙的顆粒狀凝膠結構。

FTIR光譜及二級結構定量分析表明，凍融循環導致α-螺旋和β-折疊含量下降，β-轉角和/或無規卷曲含量增加，表明蛋白質構象從有序向更無序、更靈活的狀態轉變。pH對二級結構有顯著影響，當系統pH偏離蛋白等電點時，α-螺旋含量增加，β-折疊含量減少，表明蛋白質解折疊和聚集具有pH依賴性。TGase誘導的凝膠在相同pH下比熱誘導凝膠具有更低的β-折疊含量，這增強了分子柔韌性。

內源熒光光譜用于探測蛋白質三級結構變化。凍融循環導致多數樣品的色氨酸熒光發生猝滅，表明蛋白質發生部分解折疊、三級結構改變，疏水區域暴露增加并導致聚集。值得注意的是，在pH 8.0-9.0條件下形成的凝膠，其熒光光譜受凍融過程影響最小，表明其三級構象更穩定。

紫外光譜的變化反映了蛋白質內部微環境的變化。凍融循環后，多數凝膠樣品的紫外吸收峰強度下降并伴隨藍移。然而，TGase誘導的凝膠在pH 8.0和9.0時，其紫外光譜在凍融處理后變化最小，表明其分子結構穩定性更高。

凍融處理通常導致凝膠表面疏水性(H₀)升高，這是由于蛋白質分子結構擴張，內部疏水側鏈暴露所致。在測試的所有組別中，S2-pH 9.0（TGase誘導，pH 9.0）在凍融循環前后的H₀變化最小，顯示了其結構的高度穩定性。

分子間作用力的分析表明，pH和成膠方法深刻影響了凝膠中主導的相互作用力。在pH 7.0-9.0的范圍內，二硫鍵的含量相對高于其他作用力，成為穩定凝膠網絡的主導力量。凍融循環后，所有凝膠中離子鍵和氫鍵的含量均下降，而疏水相互作用和二硫鍵的含量增加。這種變化源于凍融過程破壞了維持蛋白質高級結構的離子鍵和氫鍵，同時促進蛋白質解折疊、疏水基團暴露以及游離巰基氧化形成二硫鍵。

本研究得出明確結論：pH值和成膠誘導方法顯著影響燕麥蛋白分離物凝膠的凍融穩定性，且pH的影響比成膠方法更為顯著。pH通過改變OPI的二級和三級結構以及蛋白質-蛋白質相互作用的性質來調控凍融穩定性。當pH從酸性向堿性條件轉變時，OPI凝膠的形態從顆粒狀轉變為鏈狀結構，形成更致密的三維網絡，有效抑制了冰晶生長和水分遷移。在pH 8-9范圍內，OPI凝膠表現出相對較高的α-螺旋、β-轉角、表面疏水性(H₀)和二硫鍵含量，以及較低的β-折疊含量。相應地，其紫外和熒光光譜在凍融循環后變化最小，表明結構穩定性增強。綜合各項指標，S1-pH8.0（熱誘導）、S2-pH8.0和S2-pH9.0（均為TGase誘導）凝膠表現出最優的凍融耐受性。

該研究的核心意義在于揭示了pH調節與TGase誘導成膠的協同效應。這種組合策略通過增加蛋白質分子間的交聯密度，進一步改善了凍融穩定性，其效果優于pH調節結合熱誘導成膠。這些發現為定向設計和差異化調控具有增強凍融穩定性的燕麥蛋白分離物凝膠提供了堅實的理論依據，將有力促進其在冷凍食品產品（如植物基肉制品、冷凍甜點、冷凍面團等）中的應用，為解決植物蛋白凝膠在冷凍儲存中的品質劣變這一行業共性難題提供了創新思路和可行方案。