《Neurochemistry International》：Degradation of alpha-synuclein/SNCA mRNA by RNautophagy
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α-突觸核蛋白mRNA通過SIDT2介導的RNA自噬降解，其5'非翻譯區G富集序列是關鍵識別位點，該機制對路易體疾病病理有潛在調控意義。
Chihana Kabuta|Fumihiko Hakuno|Naoyuki Kataoka|Shin-Ichiro Takahashi|Tomohiro Kabuta
日本東京小平町大川東4-1-1，國立神經科學研究所，國家神經病學與精神病學中心，退行性神經疾病部門，郵編187-8502
摘要
<α-突觸核蛋白是一種神經元蛋白，也是路易小體的主要成分，而路易小體是帕金森病和路易小體癡呆等疾病的病理特征。雖然α-突觸核蛋白在神經元中的積累與這些疾病的發病機制有關，但其mrna降解的機制仍不甚清楚。rnautophagy是一種溶酶體rna降解途徑，其中rna直接被攝取到溶酶體中并隨后被降解。sidt2是一種溶酶體膜蛋白，介導rna的攝取。在這項研究中，我們探討了sidt2介導的rnautophagy是否能夠降解α-突觸核蛋白mrna。敲低sidt2會導致α-突觸核蛋白mrna的降解減少，而野生型sidt2的過表達則會增強其降解，這表明sidt2在α-突觸核蛋白mrna的周轉中起作用。相比之下，rna攝取缺陷的s564a突變體的過表達并未增強降解，表明rna攝取活性對于sidt2介導的α-突觸核蛋白mrna降解是必需的。通過一系列缺失突變體的分析，我們確定了α-突觸核蛋白mrna 5′非翻譯區（5′-utr）中的一個富含鳥嘌呤（g）的序列是sidt2依賴性降解的關鍵決定因素。此外，將這種富含g的序列插入gfp mrna的5′-utr中可以促進gfp>
引言
大多數帕金森病病例是散發的（90–95%）。在散發型帕金森病中，由于環境或遺傳因素導致的α-突觸核蛋白錯誤折疊被認為會形成纖維結構（Breydo等人，2012年）。在此過程中產生的可溶性寡聚體，包括原纖維，被認為具有毒性并可能導致細胞死亡（Cascella等人，2021年；Chen等人，2015年；Lindstrom等人，2014年）。因此，α-突觸核蛋白或mRNA水平的升高可能是路易小體疾病的風險因素，研究α-突觸核蛋白水平的調控機制可能為這些疾病的病理提供重要見解，并有助于開發新的治療方法。事實上，一些研究報道，在死后檢查的帕金森病患者大腦中α-突觸核蛋白mRNA水平升高（Gründemann等人，2008年；Murphy等人，2015年），這提示mRNA的產生或降解失調可能參與了疾病病理。最近的研究強調了轉錄后調控在控制α-突觸核蛋白表達中的重要性。α-突觸核蛋白mRNA 5′和非翻譯區（UTRs）中的調控元件影響其翻譯和穩定性（稍后討論）。迄今為止，α-突觸核蛋白mRNA降解的機制仍大部分未被探索。
RNautophagy是一種RNA降解過程，其中溶酶體以ATP依賴的方式直接攝取RNA并隨后將其降解（Contu等人，2023年；Fujiwara等人，2013年）。這一過程在機制上不同于巨自噬。我們之前已經證明，溶酶體膜蛋白SIDT2在RNautophagy過程中介導RNA進入溶酶體（Aizawa等人，2016年）。SIDT2是一種11次跨膜蛋白，據認為具有水解酶活性，盡管其內源性底物尚不清楚（Qian等人，2023年；Sun等人，2024年）。SIDT2的敲低顯著抑制了培養細胞中細胞內總RNA的溶酶體降解，而其過表達則顯著增強了RNA降解（Aizawa等人，2016年；Contu等人，2017年），表明多種RNA可以通過SIDT2介導的RNautophagy被降解。此外，SIDT2蛋白水平與α-突觸核蛋白水平相關，并在帕金森病和路易小體癡呆（DLB）患者的死后大腦中與磷酸化的α-突觸核蛋白聚集物共定位，這表明SIDT2與α-突觸核蛋白之間存在病理聯系。這些發現提示α-突觸核蛋白mRNA可能是這一途徑的底物。在這項研究中，我們探討了α-突觸核蛋白mRNA是否確實通過SIDT2介導的RNautophagy被降解。
實驗片段
siRNAs
針對EGFP的siRNAs（siCtrl作為對照，靶序列：5′-CAGCACGACUUCUUCAAGU-3′）、小鼠Sidt2的siRNAs（siSIDT2-A，靶序列：5′-GAGUUUCCGUCCAGUAUUU-3′）和小鼠Sidt2的siRNAs（siSIDT2-B，靶序列：5′-GUUCUGUGUUAGUCACGUA-3′）購自Japan Bio Services。除非另有說明，否則使用siSIDT2-A進行小鼠Sidt2敲低實驗。針對人類SIDT2的siRNA使用的是MISSION esiRNA（Sigma-Aldrich，EHU073391）。MISSION esiRNA是一組異質性的siRNAsSIDT2敲低抑制MEFs中內源性α-突觸核蛋白mRNA的降解
我們之前已經報道，SIDT2的敲低顯著抑制了MEFs中細胞內RNA的溶酶體降解（Aizawa等人，2016年）。為了探討SIDT2介導的RNautophagy是否能夠降解α-突觸核蛋白mRNA，我們使用放線菌素D（ActD）追蹤實驗評估了SIDT2敲低對MEFs中α-突觸核蛋白mRNA降解速率的影響（圖1A和B）。作為對比，我們還評估了其對編碼β-actin（Actb）的mRNA以及兩種參與神經退行性疾病的蛋白質的影響
CRediT作者貢獻聲明
Shin-Ichiro Takahashi：撰寫 – 審稿與編輯，監督。Naoyuki Kataoka：撰寫 – 審稿與編輯，監督。Tomohiro Kabuta：撰寫 – 審稿與編輯，數據可視化，項目管理，資金獲取，概念構思。Chihana Kabuta：撰寫 – 初稿撰寫，數據可視化，實驗設計，數據分析。Fumihiko Hakuno：撰寫 – 審稿與編輯，監督資助信息
本研究得到了日本學術振興會（Japan Society for the Promotion of Science）的科學研究資助[19H05710（授予T.K.）和武田科學基金會（Takeda Science Foundation）的研究資助。
