《Scientia Horticulturae》：Antifungal mechanism of selenium against
Botrytis cinerea on grapes: Insights from metabolomic and transcriptomic analyses
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為解決葡萄采后灰霉病造成的巨大經(jīng)濟損失及化學(xué)殺菌劑帶來的環(huán)境污染和抗藥性問題，研究人員開展了硒（Se）抑制灰霉菌（Botrytis cinerea）的機制研究。通過多組學(xué)聯(lián)合分析，揭示了Se通過破壞線粒體β-氧化、細胞壁生物合成、能量代謝及致病基因表達等多途徑協(xié)同發(fā)揮抑菌作用，為開發(fā)安全、可持續(xù)的殺菌劑替代品提供了新策略。
葡萄是全球重要的水果作物，但其采后貯藏常受到灰霉病的嚴重威脅。這種病害由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起，可導(dǎo)致果實腐爛、品質(zhì)下降，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要依賴化學(xué)合成殺菌劑進行防治，但長期使用不僅帶來了環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題，還導(dǎo)致了病原菌普遍產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找安全、有效且可持續(xù)的新型防控手段已成為當(dāng)務(wù)之急。在此背景下，硒（Selenium， Se）作為一種必需的微量元素，因其在植物生長、發(fā)育和抗逆性中的有益作用而備受關(guān)注。近年來的研究表明，硒在亞致死濃度下表現(xiàn)出廣譜的抗真菌活性，但其具體的分子作用機制尚不明確。為了深入解析硒對灰霉菌的抑菌機理，并為開發(fā)新型、多靶點的殺菌劑替代品提供理論基礎(chǔ)，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團隊開展了一項結(jié)合多組學(xué)技術(shù)的深入研究。
為了系統(tǒng)地解答上述問題，研究人員采用了體外（in vitro）與體內(nèi)（in vivo）實驗相結(jié)合的策略。關(guān)鍵技術(shù)方法包括：1) 體外抗真菌活性測定：通過在PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒（以亞硒酸鈉形式供給），評估其對灰霉菌菌絲生長和生物量的抑制作用，并確定18 mg/L為有效作用濃度。2) 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察：直觀展示硒處理對菌絲、孢子和細胞壁超微結(jié)構(gòu)的損傷。3) 細胞滲漏測定：通過檢測可溶性蛋白、糖類、核酸的泄漏以及丙二醛（MDA）含量，評估硒對細胞膜完整性和脂質(zhì)過氧化的影響。4) 多組學(xué)分析：核心部分是使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）進行非靶向代謝組學(xué)分析，以及基于Illumina NovaSeq平臺的轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）測序，以揭示硒引起的代謝物和基因表達層面的全局變化。5) 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）：驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。6) 體內(nèi)抑菌效果驗證：使用“紅地球”葡萄果實模型，評估硒處理對灰霉菌侵染和病斑擴展的實際控制效果。
3.1. 體外硒對灰霉菌的抗真菌活性
研究首先在體外評估了硒的抑菌效果。結(jié)果顯示，硒處理能以劑量依賴的方式抑制灰霉菌的菌絲生長。在18 mg/L濃度下，硒顯著減少了菌絲生物量（降低約50%）和菌落直徑，明確了其體外抑菌的有效性。
3.2. 菌絲形態(tài)的SEM觀察
通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組菌絲形態(tài)健康、表面光滑，孢子飽滿。而經(jīng)18 mg/L硒處理后，菌絲出現(xiàn)嚴重變形，包括不規(guī)則分枝、扭曲和塌陷，表面粗糙破碎，孢子皺縮坍塌，細胞壁褶皺顯著增加，直觀證明了硒對真菌細胞結(jié)構(gòu)的物理破壞。
3.3. 硒引發(fā)的灰霉菌細胞質(zhì)滲漏
硒處理顯著增加了灰霉菌細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏�？扇苄缘鞍住⑻妓衔锖秃怂岬男孤┝侩S時間推移而增加，同時指示脂質(zhì)過氧化的丙二醛（MDA）含量也顯著升高。這些結(jié)果表明硒破壞了細胞膜完整性，導(dǎo)致了不可逆的膜損傷。
3.4. 代謝組學(xué)分析
代謝組學(xué)分析揭示了硒處理引起的廣泛代謝重編程。在正、負離子模式下共鑒定出數(shù)百個差異表達代謝物（DEMs）。KEGG（京都基因與基因組百科全書）富集分析表明，這些代謝物顯著富集于嘧啶代謝、嘌呤代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝、半乳糖代謝、戊糖磷酸途徑、丙酸分解代謝以及支鏈氨基酸生物合成等通路，提示硒干擾了核酸、能量和抗氧化等多種核心代謝過程。
3.5. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
轉(zhuǎn)錄組測序共鑒定出797個差異表達基因（DEGs），其中578個下調(diào)，219個上調(diào)。基因本體（GO）富集分析顯示，DEGs顯著富集于膜的組成成分、血紅素結(jié)合等類別。KEGG通路富集分析進一步指出，硒處理顯著影響了過氧化物酶體、脂肪酸降解與代謝、氨基酸糖與核苷酸糖代謝、色氨酸代謝以及同源重組等通路。熱圖顯示，與細胞壁前體生物合成、丙酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等相關(guān)的關(guān)鍵基因表達均發(fā)生顯著改變。
3.6. 關(guān)鍵基因的qPCR驗證
研究人員選取了8個與過氧化物酶體功能、不飽和脂肪酸生物合成、毒力及丙酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵DEGs進行qRT-PCR驗證。結(jié)果顯示，qPCR與RNA-seq的表達趨勢高度一致（R2 = 0.9923），有力地證實了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。
3.7. 轉(zhuǎn)錄組與代謝組的聯(lián)合分析
多組學(xué)整合分析表明，硒處理通過擾動核酸、氨基酸、脂質(zhì)代謝以及跨膜轉(zhuǎn)運、抗氧化活性和碳水化合物代謝等多條通路，共同破壞了灰霉菌的代謝穩(wěn)態(tài)。
3.8. 硒對葡萄灰霉菌的體內(nèi)抗真菌活性
在葡萄果實模型中，18 mg/L硒處理顯著降低了灰霉菌的發(fā)病率和病斑直徑。例如，接種后48小時，對照組的病斑直徑為9.67毫米，而硒處理組僅為4.67毫米，抑制效果顯著。這證實了硒在真實的采后環(huán)境中同樣具有有效的病害控制潛力。
綜合全文的討論與結(jié)論，本研究系統(tǒng)地闡明了硒（18 mg/L）對灰霉菌的多靶點抑菌機制。首先，硒直接破壞細胞膜和細胞壁的完整性，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物泄漏和嚴重的形態(tài)學(xué)損傷。其次，硒干擾能量代謝，它抑制了線粒體脂肪酸β-氧化（反映在L-棕櫚酰肉堿水平下降），同時上調(diào)了過氧化物酶體β-氧化相關(guān)基因，但這種代償性途徑效率低下且可能產(chǎn)生有害的活性氧（ROS），最終導(dǎo)致細胞能量短缺和氧化損傷加劇。此外，硒處理還導(dǎo)致細胞壁生物合成關(guān)鍵基因的下調(diào)和前體物質(zhì)的積累，進一步削弱了細胞的結(jié)構(gòu)完整性。
在致病性方面，硒下調(diào)了與黑色素合成相關(guān)的基因Bcbrn2和與脂氧合酶相關(guān)的基因Bcole1，從而降低了真菌的毒力和侵染能力。同時，硒還抑制了ABC轉(zhuǎn)運蛋白（如ABCB1和PDR5）的表達，這可能削弱了真菌對外源毒物的外排和糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運能力。盡管硒處理也觸發(fā)了部分抗氧化反應(yīng)（如過氧化氫酶CAT基因上調(diào)），但綜合的代謝紊亂和結(jié)構(gòu)破壞效應(yīng)占據(jù)了主導(dǎo)。
最重要的是，這些基于組學(xué)的分子機制在葡萄果實模型中得到了驗證，硒處理顯著抑制了灰霉病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，硒的作用可能兼具直接抑菌和間接誘導(dǎo)宿主（葡萄）防御反應(yīng)的雙重模式。這項研究為理解硒作為一種可持續(xù)農(nóng)業(yè)投入品的抗真菌作用提供了全面的分子框架，為其替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑用于采后病害防治奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。該論文已發(fā)表于園藝學(xué)知名期刊《Scientia Horticulturae》。未來的研究可聚焦于真菌對硒的解毒途徑，以進一步推動其實際應(yīng)用。
