免疫磁性和免疫金夾心檢測方法結合飛行掃描激光解吸-電感耦合等離子體質譜（fsLA-ICP-MS）用于從血液樣本中檢測伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），作為萊姆病診斷的概念驗證
《Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy》：Immunomagnetic and immunogold sandwich assay for
Borrelia burgdorferi detection from blood samples by fsLA-ICP-MS as a proof-of-concept diagnosis of the Lyme Disease
編輯推薦：
萊姆病診斷新方法：基于磁分離和金納米顆粒標記的飛秒激光解吸-電感耦合等離子體質譜檢測，在人工血液中實現高靈敏度定性檢測，驗證了納米材料標記與fsLA-ICP-MS聯用的可行性。
安東尼亞·托斯卡（Antonia Toska）|南-塔伊·尹（Nang-Htay Yin）|多米尼克·福瓦（Dominique Foix）|范妮·克拉維里（Fanny Claverie）|梅拉尼·拉姆齊爾（Mélanie Ramseyer）|盧布娜·穆西姆（Loubna Mouhssim）|勞倫斯·林根巴赫（Laurence Ringenbach）|于格·加斯坎（Hugues Gascan）|喬阿希姆·阿盧什（Joachim Allouche）|克里斯托夫·佩謝蘭（Christophe Pécheyran）
分析科學與環境材料物理化學研究所（IPREM UMR 5254 CNRS），波城大學及阿杜爾地區大學（UPPA），Helioparc科技園區，2 Avenue du Président Pierre Angot，波城64053，法國
摘要
本文描述了一項概念驗證研究，該研究利用fsLA-ICP-MS技術，在免疫磁分離和免疫金染色之后，對人工血液樣本中的伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）進行了定性檢測，顯示出在萊姆病（LD）診斷中的巨大潛力。研究建立了一種高效的磁分離方法，用于從10毫升樣本中預濃縮B. burgdorferi并去除血液基質，該方法使用了直徑為300納米的磁性納米顆粒（MNPs），這些納米顆粒與抗B. burgdorferi抗體結合。在用直徑3納米的金納米簇（AuNCs）與另一種抗B. burgdorferi抗體結合后，對B. burgdorferi進行了197Au fsLA-ICP-MS定性檢測。整個夾心免疫測定是在添加了2·106個細菌菌落的10倍稀釋人工血液樣本中進行的，并且針對E. coli進行了特異性測試。成功檢測到了400個B. burgdorferi菌落，其197Au CPS強度比無細菌和無E. coli的陰性對照樣本高出25至20倍，顯示出在實際應用中的巨大潛力。
引言
萊姆病（LD），或稱伯氏疏螺旋體病，是歐洲最主要的媒介傳播疾病，每年新增病例約為65萬至85萬例。[1]，[2]，[3] 在美國，每年估計有47.6萬例。[4] 早期診斷對于防止疾病進展到更嚴重的階段（如神經損傷或關節炎）至關重要。[5] 然而，由于病原體Borrelia burgdorferi的特性，萊姆病的診斷仍然極具挑戰性。這種細菌在臨床樣本中的含量非常低，例如每毫升血液中只有0.1個細菌細胞，[6] 并且其基因組、在人體內的傳播方式以及地理分布存在很大差異。目前最常用的萊姆病診斷方法是間接的兩層血清學檢測，該方法旨在檢測感染后患者免疫系統的激活情況。[7] 但由于早期產生的抗體量通常較低，或者在不同個體的免疫系統反應下，這種方法的分析性能受到限制。在直接檢測方法中，通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增細菌DNA在滑液樣本中顯示出40–96%的顯著敏感性。[8] 然而，在血液樣本中，觀察到的敏感性較低，僅為10–20%，這可能是由于細菌在血液中的存在量低或短暫。此外，血液中可能存在的PCR抑制劑會進一步降低PCR的敏感性。[3]，[8]，[9] 最近在B. burgdorferi直接檢測領域取得了一些新進展。Molins等人利用液相色譜-質譜技術鑒定出一種代謝組生物標志物，能夠在血清樣本中以95%的特異性和88%的敏感性檢測到B. burgdorferi。[10] Goff等人使用拉曼光譜技術在血液樣本中檢測到B. garinii和B. afzelii，特異性和敏感性分別為90%和85%。[11] Snyder等人開發了一種T2磁共振技術，能夠在全血樣本中檢測到B. burgdorferi、B. afzelii和B. garinii，檢測限（LOD）分別為每毫升8個、8個和5個細菌細胞。[12] 盡管有這些有希望的進展，但要實現萊姆病的明確和可靠的診斷，仍需要超高靈敏度，能夠在低至每毫升0.1個細菌細胞的濃度下檢測到Borrelia，同時還需要具備多重檢測能力。
在這方面，基于元素標記的感應耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析是一種新興方法，能夠檢測到包括蛋白質、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18] 抗原、[18]、[19]、[20] 病毒顆粒、[21] 病毒、[22] 細胞[23]、[24]、[25]、[26] 和細菌[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35] 在內的生物分子，其檢測限極低。盡管ICP-MS儀器在痕量金屬分析方面表現出色，但生物分子通常難以被檢測到。生物分子中存在的元素（如C、N、O和S）具有較低的電離效率[36] 和較高的自然豐度，這些元素在化學試劑、實驗室氣氛和等離子體氣體中普遍存在，導致即使在沒有生物分析物的情況下也會增加ICP-MS的背景信號。此外，這些元素缺乏對特定生物分子的識別能力。元素標記的ICP-MS方法通過簡單地應用元素標記（如鑭系元素[16]、[17]、[18] 或金屬納米顆粒，特別是金（AuNPs）[31]、[32]、[33] 來克服這些限制。通常通過應用生物受體分子（如抗體）來實現對目標生物分子的特異性標記，這些抗體與其相應抗原的結合常數在107到1012 M?1之間。[37]
對完整細菌的ICP-MS分析特別有趣，因為它可以提供準確的細菌數量定量，這是傳統方法（如培養皿和光密度測量）無法獲得的。從實際臨床樣本中準確且超靈敏地計數細菌對于確定感染的存在和階段至關重要。針對完整細菌的單細胞（sc）-ICP-MS方法很有價值，但由于樣本引入等離子體過程中的損失而受到限制。最近，樣本引入系統的設計有了顯著改進，使得引入ICP的效率提高了100%[38]、[39]、[40]、[41]。然而，這些傳輸效率是在使用納米顆粒時評估的，而觀察到細菌引入效率有所下降[42]，同時還存在細胞大小依賴性[43]、[44]。另一方面，激光消融（LA）固體樣本引入系統可以在消融整個樣本表面后進行整體樣本分析。這樣，至少可以獲得每個樣本區域的分析信息，從而實現完整的細菌計數。LA-ICP-MS成像是一種強大的技術，具有高空間分辨率和靈敏度，使其優于其他方法（如輝光放電（GD）-MS。[45] 到目前為止，LA-ICP-MS成像已廣泛應用于各種應用中，包括與元素標記結合的蛋白質檢測（例如在印跡膜[46]或微陣列[47]中的檢測），以及肌肉[48]、組織[49]、器官[50] 和細胞的成像[51]。然而，其在細菌中的應用目前僅限于細菌蛋白質組分析[52] 和元素組成測定[53]，尚未作為細菌計數和診斷的方法進行測試。
在這項概念驗證研究中，首次建立了用于直接通過fsLA-ICP-MS分析從血液樣本中定性檢測B. burgdorferi的夾心免疫測定方法。所提出的方法基于先前的記錄（每毫升血液中存在0.1個細菌細胞[6]），開發了一種高效的磁分離方法，用于從10毫升樣本中預濃縮細菌并去除血液基質。為此，使用鏈霉親和素包覆的磁性納米顆粒（strept-MNPs）通過56Fe ICP-MS分析了兩種自制磁分離裝置的性能。首先，通過用300納米strept-MNPs與生物素化的抗B. burgdorferi抗體進行免疫磁分離來分離細菌。隨后，使用與另一種抗B. burgdorferi抗體結合的3納米AuNCs進行免疫金標記進行檢測。這項概念驗證研究證明了在緩沖樣本中特異性檢測B. burgdorferi的能力，突顯了元素標記fsLA-ICP-MS方法在萊姆病確診中的潛力。
部分內容
化學試劑
單分散超順磁顆粒Bio-Adembeads Streptavidin plus 0323（300納米，磁化強度40 emu/g，濃度5 mg/ml，結合能力>1200 pmol/mg）和Bio-Adembeads Streptavidin plus 0321（100納米，磁化強度40 emu/g，濃度5 mg/ml，結合能力>3000 pmol/mg）購自Ademtech（法國南錫）。單分散超順磁微粒Invitrogen Streptavidin Dynabeads M-280（2.8微米，結合能力650–900 pmol/mg），磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，Invitrogen），牛白蛋白/第五組分
磁分離優化
考慮到血液中B. burgdorferi的濃度非常低，每毫升血液中僅含有1個細菌[6]，因此從10毫升樣本中定量預濃縮這些細菌對于直接檢測和確診萊姆病至關重要。在本研究中，通過使用strept-MNPs和磁分離裝置實現了細菌的分離和預濃縮。圖2中展示的商業供應的strept-MNPs的TEM圖像證實了預期的形態
結論
本研究開發了一種新的分析方法，能夠通過197Au fsLA-ICP-MS從10倍稀釋的人工血液樣本中定性檢測B. burgdorferi。建立了一種新的夾心免疫測定方法，使用兩種類型的抗B. burgdorferi抗體4C3和8G2，分別與300納米strept-MNPs和3納米AuNCs結合，形成MNPs-4C3和AuNCs-8G2免疫探針。該測定方法用于從10毫升人工血液樣本中分離出2·106個B. burgdorferi菌落
CRediT作者貢獻聲明
安東尼亞·托斯卡（Antonia Toska）：撰寫——原始草稿，研究，概念構思。南-塔伊·尹（Nang-Htay Yin）：研究。多米尼克·福瓦（Dominique Foix）：研究。范妮·克拉維里（Fanny Claverie）：研究。梅拉尼·拉姆齊爾（Mélanie Ramseyer）：研究。盧布娜·穆西姆（Loubna Mouhssim）：研究。勞倫斯·林根巴赫（Laurence Ringenbach）：資源獲取，項目管理，方法學。于格·加斯坎（Hugues Gascan）：驗證，方法學。喬阿希姆·阿盧什（Joachim Allouche）：驗證，監督，方法學，概念構思。克里斯托夫·佩謝蘭（Christophe Pécheyran）：撰寫——審稿與編輯，驗證，監督，
致謝
本研究得到了波城大學及阿杜爾地區大學（UPPA）的“E2S能源環境解決方案”項目和法國國家研究署（ANR）的財政支持。作者特別感謝Alain Trautmann和Raouf Ghozzi在整個研究過程中提供的寶貴見解。
