細菌感染的傷口護理在全球范圍內疾病負擔沉重，而抗生素的濫用導致了耐藥菌感染的出現。活性氧（ROS）輔助的光動力抗菌作為一種有效的非抗生素方法受到廣泛關注，但過量ROS會對正常組織造成無差別損傷，因此光敏劑（PSs）的按需釋放是迫切需求。聚集誘導發光（AIE）PSs因其在聚集狀態下獨特的聚集增強診療（AET）特性，展現出高效的ROS生成能力，是理想的光動力抗菌劑。水凝膠因其優異的組織粘附性、吸水性和響應性等特點，被廣泛用作傷口敷料和藥物載體。結合AIE PSs與水凝膠的優勢，有望為感染傷口愈合帶來新范式。然而，大多數已報道的負載AIE PSs的水凝膠敷料主要依賴于水凝膠的自然降解來不可控地釋放PSs，難以適應傷口的動態微環境。因此，開發能夠按需釋放AIE PSs的水凝膠敷料，在確保完全殺菌的同時最小化ROS過度產生帶來的副作用至關重要。

本研究合成了一種由三苯胺（TPA）片段、噻吩單元、碳碳雙鍵和吡啶鎓部分組成的化合物TTPy-NH₂作為AIE PSs。密度泛函理論（DFT）計算顯示其電子帶隙（E_g）較小（2.184 eV），單重態-三重態能隙（ΔE_ST）顯著減小（0.1334 eV），這為高效ROS生成提供了理論支持。TTPy-NH₂在可見光區有強吸收，并在663 nm處有滿意的遠紅/近紅外發射。在甲醇/甲苯溶劑體系中，其光致發光（PL）強度在甲苯分數（f_T）超過70%后急劇增強，最終在f_T為99%時達到最大值，超過100倍的PL增強和近3倍的熒光壽命增長證實了其典型的AIE行為。使用二氯二氫熒光素（DCFH）作為指示劑的實驗表明，在可見光照射下，TTPy-NH₂存在時DCFH的熒光強度迅速增強，其總體ROS生成能力優于市售的Ce6。這些結果證實TTPy-NH₂是一種高性能的AIE PSs，適用于后續構建負載AIE PSs的水凝膠敷料。

設計理念：受病原菌通常分泌透明質酸酶（HAase）以“侵蝕”細胞外基質（如透明質酸HA）并更深感染的機制啟發，選擇HA作為敷料的響應部分，以實現基于感染程度的PSs按需釋放。選擇海藻酸鈉（SA）輔助凝膠形成，因為它可在生理條件下被Ca²⁺輕松交聯。重要的是，Ca²⁺還可作為HAase活性的調節劑。因此，使用HA和SA作為水凝膠基質，并以Ca²⁺作為交聯劑和HAase活性調節劑，可以設計出具有Ca²⁺依賴性HAase響應性和按需釋放AIE PSs能力的SAH。

物理化學性質：SAH的制備首先將TTPy-NH₂負載到HA中，然后與SA混合形成前驅體溶液，最后通過高濃度CaCl₂溶液交聯形成最終敷料。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和Zeta電位分析證實TTPy-NH₂通過分子間氫鍵成功負載到HA聚合物鏈上，而非簡單混合。流變學表征表明，Ca²⁺交聯后的SAH轉變為類固體材料，彈性模量（G'）占主導地位，表現出緊密交聯的彈性網絡。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示SAH具有完整、相互連通的多孔微結構，優化的孔隙分布有利于傷口滲出液管理和氧氣/營養擴散。力學測試顯示其壓縮模量和拉伸模量分別為48.5 ± 19.4 kPa和134.5 ± 12.5 kPa，具有出色的彈性恢復能力，適合作為傷口敷料。

釋放行為：Ca²⁺從SAH中的釋放持續增加，24小時檢測到10 mM Ca²⁺，釋放曲線與HAase存在與否無關。HAase活性研究表明，當Ca²⁺濃度低于10 mM時，HAase活性隨Ca²⁺濃度增加而增強，在10 mM時達到最大；超過10 mM則活性被抑制。與此對應，在前24小時，由于HAase活性升高，SAH降解和TTPy-NH₂釋放逐漸增強；24小時后，高濃度Ca²⁺開始使HAase失活，TTPy-NH₂釋放進入平臺期。而無HAase存在的SAH組則表現出持續但慢得多的降解和更少的TTPy-NH₂釋放。回歸分析顯示，水凝膠在不同液體環境中的溶脹率與TTPy-NH₂釋放動力學之間相關性極低（R²< 0.1），表明溶脹介質的質量轉移不是主要的釋放機制。這些結果有力地證明了所設計SAH的Ca²⁺依賴性HAase響應性以及HAase活性依賴的TTPy-NH₂釋放。

生物相容性：在黑暗條件下，TTPy-NH₂本身對小鼠成纖維細胞L929具有良好的生物相容性。在光照下，TTPy-NH₂表現出光毒性，細胞活力隨濃度增加而下降。SAH敷料本身（主要成分為FDA批準的HA和SA）在僅有HAase或僅有光照的條件下對細胞無毒性。值得注意的是，即使在HAase和光照同時存在的情況下（此時ROS生成增強），不同時間點的細胞活力仍保持在90%以上。這歸因于SAH的自我限制釋放機制：Ca²⁺的持續釋放逐漸抑制了TTPy-NH₂在24小時后的進一步擴散，將ROS產生限制在不足以對哺乳動物細胞產生細胞毒性光動力效應的水平，同時可能保留了殺菌效力。此外，SAH在所有測試體積下溶血率均低于5%的生物相容性閾值，驗證了其適用于傷口護理中的直接血液接觸。

圓二色（CD）光譜用于監測HAase與不同濃度Ca²⁺溶液相互作用時的二級結構。分析顯示，HAase的主要二級結構為α-螺旋、β-折疊和β-轉角。當Ca²⁺濃度在0至80 mM范圍內變化時，α-螺旋（被認為是最穩定和剛性的二級結構）的含量先增加后減少，在10 mM時觀察到最高的α-螺旋含量（24.3%）。相反，較松散的β-折疊則呈現相反趨勢。α-螺旋的比例與HAase活性呈正相關。

分子對接研究進一步確定了Ca²⁺與HAase的結合位點。Ca²⁺被對接到位于HAase中間的一個螺旋空腔中，并與蛋白質的Thr-163、Leu-164、Asp-170、Asp-171和Phe-172氨基酸上的O原子形成六配位相互作用，這首次提示了Ca²⁺與HAase之間存在配位鍵，為Ca²⁺增強HAase構象穩定性的能力提供了進一步解釋。

通過軟件分析，在HAase的三級結構中發現大量疏水性氨基酸和10個疏水簇。根據先前研究，當高濃度Ca²⁺（作為強電解質）優先與蛋白質內的H₂O分子結合時，這些簇容易暴露并通過疏水相互作用導致HAase鹽析。三維熒光光譜進一步驗證了這一點：當Ca²⁺濃度超過10 mM時，在峰2處出現眾多異質且寬的峰，明顯暗示了蛋白質分子的鹽沉淀。

綜上所述，基于分子模擬和實驗結果可以得出結論：低濃度Ca²⁺通過穩定HAase的空間結構來提高其活性，這種穩定是通過刺激HAase轉化為其優選構象并與HAase形成配位鍵實現的。相反，高濃度Ca²⁺（>10 mM）導致HAase鹽沉淀，使其失活。

在評估抗菌活性之前，確認了TTPy-NH₂與大腸桿菌（E. coli，革蘭氏陰性菌代表）、金黃色葡萄球菌（S. aureus，革蘭氏陽性菌代表）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA，多重耐藥菌代表）的強結合親和力。與TTPy-NH₂孵育15分鐘后，所有三種細菌均發出明亮的紅色熒光。

抗菌效率測試顯示，當TTPy-NH₂濃度達到2 μg/mL時，S. aureus和MRSA的繁殖被完全抑制；對于E. coli，則需要高于3 μg/mL的TTPy-NH₂濃度。保持在黑暗中的對照組沒有明顯的殺菌活性。所有細菌分泌的HAase濃度與其濃度呈正相關，即使在低細菌濃度（10²CFU/mL）下，分泌的HAase濃度也足以觸發TTPy-NH₂的釋放。

抑制區實驗表明，僅用三滴水凝膠即可完全消除整個培養物。測試SAH在高（10⁷CFU/mL）和低（10³CFU/mL）細菌濃度下的光動力抗菌效率（根據世界衛生組織WHO標準，高于10³CFU/mL通常被視為感染濃度）。在低細菌濃度下，SAH仍能在4小時內釋放足夠的TTPy-NH₂完全殺死所有三種細菌。然而，當細菌濃度高時，需要更長時間（8小時）積累更多釋放的TTPy-NH₂來清除MRSA。總體而言，制備的敷料表現出優異的抗菌效果。

建立全層皮膚感染傷口模型以評估SAH促進傷口愈合的效率。實驗組設置為：僅傷口、3M膠帶（傷口覆蓋商業膠帶）、TTPy-NH₂、不含TTPy-NH₂的SAH（僅水凝膠）和SAH（負載TTPy-NH₂的水凝膠）。所有組均接受光照。僅傷口組出現撕裂和化膿，表明嚴重感染。3M膠帶組和TTPy-NH₂組的傷口愈合情況較僅傷口組有所改善。對于不含TTPy-NH₂的SAH組和SAH組，在治療期間傷口區域未出現黃色膿液，傷口保持濕潤直至形成痂。在愈合率方面，兩個水凝膠組表現出比其他三組更快的愈合，SAH組最先達到完全的傷口愈合率。

蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示，在第七天，僅傷口組、3M膠帶組和TTPy-NH₂組有明顯結痂，不含TTPy-NH₂的SAH組有小結痂，SAH組結痂可忽略不計。到第14天，只有SAH組顯示出顯著愈合，并擁有最完整的再生皮膚附屬器，如毛囊。值得注意的是，TTPy-NH₂組表現出廣泛的組織壞死和局灶性鈣化，特別是在鄰近的結締組織中，暗示過量的ROS可能阻礙正常的愈合過程。SAH組再生的表皮層比其他組更均勻，厚度為23.3 ± 8.0 μm，最接近健康皮膚的厚度，表明SAH組具有優越的皮膚再上皮化。

抗菌效果：從傷口部位收集組織液進行培養。經SAH處理的組在第1天細菌被完全根除。而不含TTPy-NH₂的SAH組需要4天才能消除細菌。當TTPy-NH₂直接添加到受傷組織時，盡管在第1天殺死了所有細菌，但似乎不如SAH組有效。

炎癥與增殖評估：腫瘤壞死因子α（TNF-α）是傷口愈合炎癥反應階段的代表因子。在第7天，SAH組的TNF-α表達水平顯著高于其他組，表明更多的中性粒細胞和單核細胞被募集到傷口部位并分化為炎癥表型巨噬細胞（M1）。隨后，在第14天，SAH組的TNF-α表達顯著下調，這有利于傷口愈合。同時，作為促進傷口愈合再生階段的關鍵抗炎細胞因子，白細胞介素-10（IL-10）在第14天于SAH組的表達高于其他組。從第7天到第14天炎癥環境的變化表明傷口在第14天已過渡到增殖階段。使用Ki67免疫染色評估肉芽組織形成期間的細胞增殖活性。SAH組的Ki67表達在第7天顯著較高，但在第14天明顯低于所有其他組，這表明傷口從增殖階段進展到重塑階段，并且第14天Ki67的降低也提示了對異常組織增殖的抑制。

重塑過程評估：Masson三色染色用于評估傷口組織中膠原的形成。在第14天，兩個水凝膠組（第4組和第5組）的膠原沉積顯著高于TTPy-NH₂組。作為評估血管化的典型標志物，血小板-內皮細胞粘附分子1（CD31）的表達在第14天于SAH組顯著升高，證明SAH在促進感染傷口血管生成方面具有優勢。在傷口愈合過程中，活化的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并以新表達的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）為標志。通常在傷后約一周開始形成肉芽組織。分析α-SMA的表達，在第7天，第4組和第5組觀察到高水平，其中SAH組的表達最為明顯，表明傷口閉合更快。此外，在第14天，SAH組的α-SMA水平與其他組相比顯著下降，這可能是由于SAH組肉芽組織形成減少，促進了傷口重塑。

總體而言，SAH憑借其按需釋放TTPy-NH₂的有利能力，在促進傷口愈合方面表現出卓越的功效。此外，它還合理地調節炎癥和抗炎過程，并加速傷口的細胞增殖和重塑階段。

總之，我們成功設計了一種新型抗菌水凝膠，該水凝膠通過Ca²⁺依賴性HAase響應機制，能夠按需釋放AIE PSs，用于治療感染傷口。該傷口敷料是通過將抗菌TTPy-NH₂摻入由HA和SA組成的聚合物水凝膠網絡中，并在Ca²⁺溶液中交聯制成的。當暴露于濃度低于10 mM的Ca²⁺時，HAase傾向于采用更穩定的構象，α-螺旋含量增加，并與Ca²⁺形成配位鍵，最終促進HAase的活性。然而，Ca²⁺濃度超過10 mM會導致HAase鹽沉淀和失活。Ca²⁺依賴性HAase響應性賦予所得SAH按需釋放TTPy-NH₂的優勢能力，這既能在初始階段實現足夠的AIE PSs釋放以清除細菌，也能及時啟動關閉機制，以防止不必要的細胞毒性和過量ROS造成的損傷。憑借所有這些有益特性，SAH在S. aureus感染的全層皮膚傷口模型中展示了促進傷口愈合的優異性能。值得一提的是，這項工作首次報道了HAase的Ca²⁺依賴性響應，并借助分子建模和光譜分析進一步闡明了相應的調控機制。此外，我們相信所開發的水凝膠敷料作為下一代基于ROS的抗菌傷口敷料在臨床應用中具有巨大潛力。