水稻中參與干旱脅迫響應(yīng)的OsbZIP62基因的同源物通過比較基因組分析在玉米中被鑒定，命名為ZmbZIP92。該基因編碼的蛋白質(zhì)被歸類于玉米11個(gè)bZIP亞類中的第I亞組，包含用于結(jié)合DNA的堿性區(qū)域和介導(dǎo)蛋白質(zhì)二聚化的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析顯示，玉米ZmbZIP92與水稻OsbZIP62及高粱Sobic-002G425600親緣關(guān)系密切，暗示其可能編碼一個(gè)調(diào)控玉米耐旱性的因子。相關(guān)圖示展示了ZmbZIP92的系統(tǒng)發(fā)育樹及多序列比對結(jié)果，其保守的bZIP和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域清晰可見。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了ZmbZIP92在不同玉米組織中的表達(dá)譜及其對脫落酸(ABA)、氯化鈉(NaCl)、PEG-6000(模擬干旱脅迫)和高溫(42^oC)處理的響應(yīng)。數(shù)據(jù)顯示，所有測試的非生物脅迫均能誘導(dǎo)ZmbZIP92表達(dá)，表現(xiàn)為快速上升后逐漸下降的趨勢。在組織特異性表達(dá)方面，ZmbZIP92的轉(zhuǎn)錄本豐度在根、葉、胚和胚乳中相對較高，而在八葉期的莖和開花期的花絲中則較低。

為確定ZmbZIP92的亞細(xì)胞定位和分子特性，將其不含終止密碼子的編碼序列與綠色熒光蛋白(GFP)編碼序列融合構(gòu)建表達(dá)載體，隨后在本氏煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。ZmbZIP92-GFP融合蛋白發(fā)出的綠色熒光定位于煙草葉細(xì)胞的細(xì)胞核，其熒光信號(hào)與核定位信號(hào)-mCherry標(biāo)記的核區(qū)空間分布高度重疊，而單獨(dú)的GFP熒光則在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均被檢測到。因此，ZmbZIP92是一種核蛋白。為了分析ZmbZIP92的轉(zhuǎn)錄自激活能力，將其全長編碼序列克隆到pGBKT7載體并轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。攜帶pGBKT7-ZmbZIP92的酵母細(xì)胞與陰性對照一樣，無法在含有X-α-gal的SD/?Trp/?His/?Ade選擇培養(yǎng)基上生長，反映了在實(shí)驗(yàn)條件下其缺乏轉(zhuǎn)錄自激活活性。

G-box(核心序列：CACGTG)是bZIP轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)。為了確定ZmbZIP92是否特異性結(jié)合此順式調(diào)控元件，構(gòu)建了重組載體pGreenII 62-SK-ZmbZIP92和pGreenII 0800-G-box進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。實(shí)驗(yàn)組(62-SK-ZmbZIP92和0800-G-box)檢測到顯著的熒光素酶發(fā)光信號(hào)，而任何對照組均未檢測到，這表明ZmbZIP92特異性結(jié)合G-box元件。

構(gòu)建了在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下過表達(dá)ZmbZIP92的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。通過PCR和qRT-PCR鑒定出三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系，其中L5株系的ZmbZIP92表達(dá)水平最高。選擇L4、L5和L10株系用于后續(xù)分析。干旱脅迫對野生型(WT)和ZmbZIP92過表達(dá)植株均產(chǎn)生了不利影響(生長受抑制、萎蔫、葉片黃化)。重新澆水后，轉(zhuǎn)基因植株幾乎完全恢復(fù)，而野生型植株的恢復(fù)則嚴(yán)重受損，這反映了轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)的耐旱性。生理分析進(jìn)一步揭示，在干旱條件下，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株具有更高的過氧化物酶(POD)活性和葉片相對含水量(RWC)。此外，它們積累了更少的活性氧(ROS)，具有更低的丙二醛(MDA)含量。在甘露醇模擬的干旱條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的根系生長均受到抑制。然而，在200和300 mM甘露醇處理下，ZmbZIP92過表達(dá)植株的根系顯著長于野生型植株，進(jìn)一步支持了它們對干旱類似條件的耐受性提高。相關(guān)圖片展示了干旱脅迫及復(fù)水后的表型對比，以及POD活性、RWC和MDA含量的生理指標(biāo)數(shù)據(jù)。

外源ABA處理能快速誘導(dǎo)ZmbZIP92表達(dá)。為了評(píng)估這種誘導(dǎo)是否改變了ABA響應(yīng)性，比較了野生型和轉(zhuǎn)基因植株在0.5或1 μM ABA處理下的種子萌發(fā)率。在兩種ABA濃度下，ZmbZIP92過表達(dá)株系的萌發(fā)抑制程度均顯著高于野生型對照。因此，ZmbZIP92過表達(dá)似乎增加了擬南芥對ABA的敏感性。相關(guān)圖表統(tǒng)計(jì)了不同ABA濃度下的萌發(fā)率。

對遭受干旱脅迫的野生型和L5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。在通過主成分分析確認(rèn)樣本一致性和測序數(shù)據(jù)質(zhì)量后，共鑒定出7405個(gè)差異表達(dá)基因，其中4922個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)上調(diào)，2483個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過功能注釋篩選出28個(gè)與ABA信號(hào)傳導(dǎo)和脅迫適應(yīng)相關(guān)的基因。聚類分析表明，其中16個(gè)基因在干旱條件下表達(dá)上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。功能注釋顯示，上調(diào)基因包括參與ABA相關(guān)通路的ASPG1(AT3G18490)和RCAR3(AT5G53160)，以及編碼跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)蛋白的PIP2A(AT3G53420)、PIP1;5(AT4G23400)、PIP1C(AT1G01620)、PIP2B(AT2G37170)、PIP3(AT4G35100)和TIP2;2(AT4G17340)等。而下調(diào)基因(如AT3G02140、AT3G11410等)據(jù)報(bào)道與ABA抑制性響應(yīng)有關(guān)。這些基因表達(dá)的下調(diào)可能有助于ABA積累和增強(qiáng)耐旱性。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，ZmbZIP92可能通過調(diào)節(jié)ABA相關(guān)信號(hào)通路和協(xié)調(diào)參與脅迫適應(yīng)及水分穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來增強(qiáng)耐旱性。

作為全球最重要的糧食、飼料和能源作物之一，玉米容易受到干旱脅迫的影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量和品質(zhì)損失。越來越多的證據(jù)表明，多種基因類型參與植物干旱脅迫響應(yīng)，以減輕干旱對生長發(fā)育的不利影響。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物響應(yīng)鹽分、干旱和極端溫度等非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在植物中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子由一個(gè)相對較大的基因家族編碼。先前的研究已鑒定出170個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子(由125個(gè)基因編碼)，根據(jù)它們與擬南芥和水稻同源物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系被分為11個(gè)亞家族。本研究基于與水稻OsbZIP62(正向調(diào)節(jié)水稻耐旱性)的同源性，鑒定出玉米干旱響應(yīng)相關(guān)基因ZmbZIP92。擬南芥中間源物EEL也被報(bào)道可增強(qiáng)耐旱性。

表達(dá)譜分析表明，ZmbZIP92在根、葉和特定組織中表達(dá)，在三葉期的根和葉中轉(zhuǎn)錄本豐度達(dá)到峰值。ZmbZIP92的表達(dá)受到多種非生物脅迫和外源ABA的顯著誘導(dǎo)，尤其是干旱和ABA，表明該基因可能編碼一個(gè)在非生物脅迫響應(yīng)中具有關(guān)鍵功能的蛋白質(zhì)。ZmbZIP92的核定位進(jìn)一步支持了其作為典型bZIP轉(zhuǎn)錄因子的鑒定。盡管在酵母中未檢測到ZmbZIP92的轉(zhuǎn)錄自激活活性，但這與OsbZIP62和OsbZIP46的報(bào)道類似，暗示它們可能存在共同的保守調(diào)控機(jī)制。

為闡明ZmbZIP92在干旱條件下的功能，獲得了ZmbZIP92過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。甘露醇處理促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的根系伸長，隨后的水分虧缺脅迫試驗(yàn)顯示其耐旱性顯著提高。因此，ZmbZIP92的表達(dá)似乎對植物適應(yīng)干旱脅迫的響應(yīng)很重要。轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)的脅迫耐受性表現(xiàn)為POD活性和RWC的增加以及MDA含量的降低。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，ZmbZIP92過表達(dá)賦予植物更強(qiáng)的耐旱性，這歸因于其對干旱脅迫響應(yīng)的正向調(diào)節(jié)。因此，ZmbZIP92作為一個(gè)正向調(diào)節(jié)干旱脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用；其生物學(xué)功能與其水稻直系同源物OsbZIP62是保守的。轉(zhuǎn)錄因子主要通過結(jié)合下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而使植物適應(yīng)各種外界脅迫。本研究確定ZmbZIP92能夠結(jié)合下游靶基因的G-box元件并介導(dǎo)其表達(dá)�；�于RNA測序數(shù)據(jù)鑒定了可能受ZmbZIP92調(diào)控的基因。根據(jù)顯著富集的GO條目，所鑒定的7405個(gè)差異表達(dá)基因與對ABA、鹽脅迫、水分剝奪和氧化脅迫的響應(yīng)相關(guān)。KEGG通路分析表明，大多數(shù)差異表達(dá)基因參與MAPK信號(hào)通路和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，這些基因可能有助于擬南芥對干旱脅迫的適應(yīng)性響應(yīng)。ZmbZIP92的表達(dá)受ABA施用顯著誘導(dǎo)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對外源ABA增加的敏感性。這表明ZmbZIP92可能并非均一地放大ABA信號(hào)傳導(dǎo)的所有下游效應(yīng)，而是在脅迫條件下優(yōu)化植物資源分配。

ABA敏感性的增加使植物能夠相對較早和迅速地啟動(dòng)基本的防御反應(yīng)，如氣孔關(guān)閉。更重要的是，在整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，我們推測ZmbZIP92優(yōu)先激活與脅迫適應(yīng)直接相關(guān)的ABA響應(yīng)基因，包括與水分保持和ROS清除相關(guān)的基因。同時(shí)，ZmbZIP92可能對強(qiáng)烈抑制細(xì)胞生長和擴(kuò)張的ABA信號(hào)傳導(dǎo)影響有限。這種對ABA信號(hào)通路下游的差異性調(diào)節(jié)使植物能夠在干旱條件下優(yōu)先保證生存，從而增強(qiáng)整體抗逆性，而無需付出過高的生長代價(jià)。然而，由于缺乏直接的結(jié)合證據(jù)，目前尚不清楚已鑒定的差異表達(dá)基因是否由ZmbZIP92直接靶向�；蛘�，觀察到的這些基因表達(dá)的變化可能是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的間接響應(yīng)。這種可能性降低了ZmbZIP92結(jié)合G-box啟動(dòng)子元件并激活下游基因表達(dá)的直接機(jī)制證據(jù)。

盡管在擬南芥中的異源表達(dá)分析表明ZmbZIP92參與了ABA依賴的干旱響應(yīng)，但該轉(zhuǎn)錄因子在玉米中是否以類似方式發(fā)揮作用仍有待確定。單子葉植物獨(dú)特的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能會(huì)改變ZmbZIP92的分子機(jī)制或靶基因特異性。未來需要通過玉米的功能缺失和功能獲得分析來進(jìn)行明確的功能驗(yàn)證。

本研究對玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP92進(jìn)行了功能鑒定。系統(tǒng)發(fā)育分析將其歸類為bZIP家族的第I組成員，同時(shí)也揭示了其與擬南芥和水稻bZIP蛋白的同源性。亞細(xì)胞定位證實(shí)ZmbZIP92是一種核蛋白。此外，ZmbZIP92的表達(dá)受鹽分和干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)。盡管全長蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄自激活活性，但它被觀察到能特異性結(jié)合G-box順式元件。在干旱條件下，過表達(dá)ZmbZIP92的擬南芥植株表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性，其特征是葉片相對含水量(RWC)和過氧化物酶(POD)活性顯著增加，以及丙二醛(MDA)積累減少。此外，ZmbZIP92過表達(dá)植株比野生型植株對ABA更敏感。分子分析表明，在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，ZmbZIP92過表達(dá)調(diào)節(jié)了關(guān)鍵ABA信號(hào)通路基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)正調(diào)節(jié)因子并下調(diào)負(fù)調(diào)節(jié)因子�？傊�，研究數(shù)據(jù)表明ZmbZIP92正向調(diào)節(jié)玉米的干旱脅迫響應(yīng)，同時(shí)也為解析玉米耐旱機(jī)制提供了重要的分子見解。