慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease, CKD）影響著全球至少10%的人口，其特征是腎功能逐漸下降，最終可能發展為尿毒癥，并與心血管疾病風險增加相關。腎小管上皮細胞（Renal Tubular Epithelial Cells, RTECs）的死亡是CKD進展的關鍵病理機制之一。近年來，鐵死亡（ferroptosis）——一種由鐵依賴的脂質過氧化驅動的程序性細胞死亡形式——被證實與腎小管變性密切相關，成為CKD干預的潛在靶點。核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）是關鍵的抗氧化轉錄因子，而糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）可通過磷酸化NRF2促進其泛素化降解。GSK3β/NRF2通路是調節細胞氧化還原穩態的關鍵通路。女貞子黃酮（Ligustroflavone, LIG）是從女貞子中提取的黃酮類化合物，據報道具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等多種生物活性。本研究旨在探究女貞子黃酮在CKD中的保護作用及其潛在的分子機制。

本研究采用了體內和體外實驗相結合的策略。在體內部分，研究人員構建了單側輸尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）和葉酸誘導腎病（Folic Acid-induced Nephropathy, FAN）兩種小鼠CKD模型。將小鼠隨機分為假手術組、模型組、女貞子黃酮+假手術組、女貞子黃酮+模型組，女貞子黃酮以每日30 mg/kg體重的劑量通過灌胃給予。在體外部分，使用小鼠腎小管上皮細胞（MPTCs），并用鐵死亡誘導劑erastin進行處理。通過蛋白質印跡（Western Blotting, WB）、定量實時逆轉錄聚合酶鏈反應（Quantitative Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）、免疫熒光（Immunofluorescence, IF）和免疫組織化學（Immunohistochemistry, IHC）等技術，在體內和體外評估腎小管損傷、纖維化、炎癥、氧化應激及鐵死亡相關指標。此外，還使用了CCK-8、LDH釋放、Edu增殖、TUNEL凋亡、BODIPY-C11脂質過氧化探針、鐵含量測定、細胞熱位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）等多種實驗方法，并利用分子對接軟件預測了女貞子黃酮與GSK3β的潛在結合。

與假手術組相比，UUO小鼠腎臟表現出明顯的結構異常，包括腎小管管腔擴張和刷狀緣脫落。女貞子黃酮治療顯著減輕了這些損傷。天狼星紅染色顯示，UUO小鼠腎間質膠原沉積（纖維化）顯著增加，而女貞子黃酮治療顯著減少了細胞外基質沉積。免疫熒光和蛋白質印跡分析進一步證實，女貞子黃酮有效抑制了UUO誘導的膠原I（COL1A1）、纖連蛋白（fibronectin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin, α-SMA）等纖維化相關蛋白的表達上調。

TUNEL染色顯示，UUO腎臟中RTECs凋亡顯著增加，女貞子黃酮給藥顯著減少了細胞死亡。蛋白質印跡分析表明，女貞子黃酮逆轉了UUO誘導的腎損傷標志物腎損傷分子-1（Kidney Injury Molecule-1, KIM-1）和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, NGAL）的表達上調。IHC染色顯示，UUO腎臟中F4/80陽性的巨噬細胞浸潤顯著增加，女貞子黃酮治療顯著減少了巨噬細胞浸潤。qRT-PCR分析證實，女貞子黃酮顯著降低了UUO腎臟中促炎細胞因子白介素1β（IL1β）、白介素6（IL6）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和單核細胞趨化蛋白1（MCP1）的表達。

分子對接預測顯示，女貞子黃酮可直接與GSK3β結合。CETSA實驗進一步證實，女貞子黃酮處理引起了GSK3β熱熔曲線的右移，表明其與GSK3β存在直接結合。在MPTCs中，女貞子黃酮處理顯著降低了GSK3β在Tyr216位點的磷酸化水平，表明抑制了GSK3β的活性，同時上調了NRF2及其下游靶基因血紅素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1, HO-1）的表達。免疫熒光分析證實，女貞子黃酮促進了NRF2的核轉位。在體實驗中，灌胃給予女貞子黃酮7天有效抑制了腎組織中GSK3β的活性，并增強了近端小管標記物LTL與NRF2的共定位。

在UUO小鼠模型中，腎臟可螯合Fe²⁺含量顯著升高，谷胱甘肽（Glutathione, GSH）/氧化型谷胱甘肽（Glutathione Disulfide, GSSG）比值降低，丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平升高，長鏈脂酰輔酶A合成酶4（Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4, ACSL4）和前列腺素內過氧化物合酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, PTGS2）的mRNA表達上調。女貞子黃酮治療逆轉了所有這些鐵死亡相關指標的變化。蛋白質印跡分析顯示，女貞子黃酮降低了UUO誘導的p-GSK3β表達，同時上調了NRF2和GPX4蛋白水平。IHC染色表明，UUO顯著增加了脂質過氧化終產物4-羥基壬烯醛（4-Hydroxynonenal, 4-HNE）的表達，而女貞子黃酮治療使其恢復正常水平。透射電鏡觀察發現，UUO腎臟線粒體出現嚴重的結構損傷，包括嵴解體、萎縮和膜破裂，女貞子黃酮治療減輕了線粒體損傷。

在體外，erastin處理降低了MPTCs的細胞活力，增加了LDH釋放和MDA積累，降低了GSH/GSSG比值，并導致BODIPY-C11熒光探針從紅色（還原態）向綠色（氧化態）轉變，表明發生了脂質過氧化和鐵死亡。女貞子黃酮以濃度依賴性的方式（最佳濃度20 μM）減輕了erastin誘導的這些細胞毒性作用，恢復了細胞活力，并抑制了脂質過氧化。當在MPTCs中敲低GSK3β后，女貞子黃酮未能挽救erastin處理導致的細胞活力下降，這表明女貞子黃酮的抗鐵死亡作用依賴于GSK3β通路。此外，用erastin處理的MPTCs的培養上清液能夠促進大鼠腎成纖維細胞NRK-49F的增殖（Edu陽性細胞增加）和α-SMA表達上調（肌成纖維細胞活化），而用女貞子黃酮和erastin共同處理的MPTCs上清液則顯著抑制了NRK-49F的活化和增殖。

在另一種穩定的CKD模型——FAN模型中，女貞子黃酮同樣極大地減輕了由葉酸引起的腎小管周圍膠原沉積，并顯著降低了FAN組中強烈誘導的纖連蛋白和α-SMA的表達，證實了女貞子黃酮在FAN誘導的CKD中也具有減少腎纖維化和改善鐵死亡相關損傷的作用。

本研究首次報道了女貞子黃酮在慢性腎臟病中對鐵死亡的抑制作用及其機制。研究表明，女貞子黃酮通過直接結合并抑制GSK3β的活性，阻斷其對NRF2的磷酸化和降解，從而促進NRF2核轉位，上調包括GPX4在內的下游抗氧化基因的表達。這一過程有效抑制了腎小管上皮細胞中鐵依賴的脂質過氧化積累，減輕了細胞鐵死亡，進而減少了炎癥細胞浸潤、細胞外基質沉積和腎纖維化，最終在UUO和FAN兩種CKD動物模型中發揮了腎臟保護作用。盡管本研究尚未通過實驗直接證實女貞子黃酮與GSK3β的物理結合，但多項證據強烈支持這一作用機制。這些發現不僅拓展了女貞子黃酮已知的抗炎、抗氧化藥理活性，更重要的是，明確了其通過GSK3β/NRF2/GPX4軸抑制鐵死亡是緩解CKD的關鍵分子途徑，為將女貞子黃酮開發為治療CKD的潛在新型藥物提供了堅實的臨床前實驗依據和理論支撐。