在免疫系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，有一類特殊的細胞亞群——17型免疫細胞，它們是我們抵抗病原體入侵和組織修復(fù)的重要衛(wèi)士，但也與多種自身免疫病和炎癥性疾病的發(fā)生息息相關(guān)。這類細胞包括輔助性T細胞17（T_H17）、3型固有淋巴細胞（ILC3s）、表達RORγt的調(diào)節(jié)性T細胞（RORγt⁺T_reg）和γδT細胞等。它們的共同“指揮官”是一個名為視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt（Retinoic acid receptor–related orphan receptor γt, RORγt）的轉(zhuǎn)錄因子。RORγt就像這些細胞的“身份標識”和功能開關(guān)，決定了它們是否能正常發(fā)育、存活并行使功能。然而，科學家們長期以來面臨一個核心謎題：在基因組中，編碼RORγt的Rorc基因，其自身的“開關(guān)”（即轉(zhuǎn)錄調(diào)控）是如何被精確控制的？雖然我們知道有一些蛋白質(zhì)（反式作用因子）能調(diào)控它，但對于基因所在的DNA序列上哪些特定區(qū)域（順式調(diào)控元件）在起關(guān)鍵作用，尤其是在ILC3等固有免疫細胞中，認知仍不完整。解決這個問題，對于深入理解免疫細胞分化的底層邏輯，以及開發(fā)針對相關(guān)疾病的潛在療法至關(guān)重要。

為了解答這個謎題，研究團隊將目光投向了一個名為保守非編碼序列11（CNS11）的DNA區(qū)域。先前的研究提示它可能參與調(diào)控RORγt，但缺乏確鑿的遺傳學證據(jù)和深入的機制闡釋。于是，研究人員開展了一項系統(tǒng)性的研究，首次通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建了CNS11完全缺失（CNS11^?/?）的小鼠模型，并像偵探一樣，從表型到機制，層層深入地揭示了CNS11的核心作用。他們的發(fā)現(xiàn)證實，CNS11是Rorc基因轉(zhuǎn)錄的“主控區(qū)域”，它的缺失會導(dǎo)致一系列驚人的后果：小鼠完全喪失了淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和派爾集合淋巴結(jié)等次級淋巴器官（SLOs）；腸道中的ILC3s徹底消失；T_H17、RORγt⁺T_reg和RORγt⁺γδT細胞也無法產(chǎn)生。這表明，CNS11是多種17型免疫細胞正常發(fā)育和功能所不可或缺的“總開關(guān)”。這項意義重大的研究成果發(fā)表在了國際頂級期刊《SCIENCE ADVANCES》上。

為了開展這項研究，作者綜合運用了多種前沿的生物技術(shù)方法。核心是使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了CNS11條件性和全身性敲除小鼠模型，為表型分析提供了基礎(chǔ)。在機制探索上，采用了染色質(zhì)可及性測序（ATAC-seq）和切割標簽測序（CUT&Tag-seq）來分析CNS11區(qū)域的開放狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況；通過DNA pull-down結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選與CNS11直接相互作用的蛋白質(zhì)；利用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CCNS11的增強子活性及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的功能；通過染色體構(gòu)象捕獲測序（4C-seq）證實CNS11與Rorc啟動子之間存在物理互作環(huán)。此外，還建立了骨髓嵌合體小鼠、向?qū)�RNA（sgRNA）介導(dǎo)的體內(nèi)基因編輯模型、髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（MOG）免疫模型、實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型和葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，以在體內(nèi)外多維度驗證CNS11的細胞自主性功能及其在免疫應(yīng)答和疾病中的作用。

研究結(jié)果：研究人員通過一系列精巧的實驗，逐步揭開了CNS11的神秘面紗。

CNS11是誘導(dǎo)RORγt表達淋巴細胞和小鼠SLO發(fā)育所必需的：分析公共數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CNS11在ILC3s中染色質(zhì)高度開放。CNS11^?/?小鼠表現(xiàn)出與Rorc基因全身敲除小鼠類似的表型：完全缺失SLOs，腸道中ILC3s、T_H17、RORγt⁺T_reg和RORγt⁺γδT細胞全部消失，且這些細胞分泌IL-17A/IL-22的能力也嚴重受損。這些表型在骨髓嵌合體實驗中被證實是細胞自主性的。有趣的是，CNS11雜合缺失（CNS11^+/?）小鼠雖然細胞比例變化不大，但細胞內(nèi)的RORγt蛋白水平已顯著降低，說明CNS11以劑量依賴方式調(diào)控Rorc轉(zhuǎn)錄。

CNS11對T_H17細胞維持至關(guān)重要，但在分化中作用有限：體外實驗顯示，CNS11缺失對初始CD4⁺T細胞向T_H17分化影響很小。然而，在體內(nèi)MOG免疫或EAE疾病模型中，CNS11缺失的T_H17細胞在早期能正常誘導(dǎo)RORγt，但隨后無法維持其表達，最終導(dǎo)致細胞功能喪失。這表明CNS11是成熟T_H17細胞長期存在的“維持者”，而非“啟動者”。

刪除CNS11會阻斷ILC3前體細胞和ILC3s的發(fā)育：在CNS11^?/?小鼠的骨髓和胎肝中，共同淋巴樣祖細胞（CLPs）、α4β7⁺淋巴樣祖細胞（αLPs）等早期祖細胞正常，但向淋巴組織誘導(dǎo)細胞前體（LTiPs）和RORγt⁺的ILC祖細胞（ILCPs）的發(fā)育被完全阻斷。體外培養(yǎng)實驗也證實，來自CNS11^?/?小鼠的輔助樣ILC共同祖細胞（CHILPs）完全無法分化為ILC3s。在Rag1^?/?CNS11^?/?小鼠的DSS結(jié)腸炎模型中，疾病顯著加重，且結(jié)腸ILC幾乎不分泌IL-17A和IL-22。這與T_H17細胞不同，說明CNS11是ILC3s發(fā)育程序啟動的“必需品”。

CNS11缺陷小鼠的RORγt⁺抗原呈遞細胞（APCs）減少：最近發(fā)現(xiàn)的RORγt⁺APCs對腸道免疫耐受至關(guān)重要。CNS11^?/?小鼠脾臟中此類細胞顯著減少，特別是CD127⁺CXCR6⁺MHCII⁺的ILC3亞群完全缺失，剩余的CD127^?CXCR6^?非ILC3 RORγt⁺APCs其RORγt和MHCII表達也大幅降低。骨髓嵌合體實驗證實其發(fā)育缺陷是細胞自主性的。

CNS11通過協(xié)同機制被RORγt和RUNX3直接激活：機制探索是研究的核心。DNA pull-down實驗從ILC3s核提取物中釣出了與CNS11特異性結(jié)合的蛋白，包括RUNX3和RORγt。報告基因?qū)嶒炞C明CNS11具有增強子活性，其核心功能區(qū)（CNS11-3）內(nèi)包含RUNX響應(yīng)元件（RXRE）和ROR響應(yīng)元件（RORE）。CUT&Tag實驗證實RUNX3和RORγt確實結(jié)合在此區(qū)域。過表達實驗顯示，RORγt和RUNX3能協(xié)同大幅增強CNS11的活性。4C-seq實驗則捕獲到了CNS11與Rorc啟動子之間存在的染色質(zhì)環(huán)，這可能是其發(fā)揮遠程調(diào)控作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

CNS11通過結(jié)合RORγt和RUNX3在體內(nèi)調(diào)控RORγt表達和RORγt表達細胞：為了在體內(nèi)驗證上述結(jié)合位點的功能，研究團隊設(shè)計了更精巧的實驗：利用表達靶向RORE或RXRE的sgRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染Cas9小鼠的骨髓細胞，然后移植入受體鼠，實現(xiàn)體內(nèi)特異性基因編輯。結(jié)果顯示，突變RORE幾乎完全阻斷了ILC3、T_H17、RORγt⁺T_reg和RORγt⁺γδT細胞的發(fā)育；而突變RXRE主要影響ILC3s，對其他細胞影響較小。這說明了RORE的普遍重要性和RXRE在ILC3s中的特異性。利用條件性基因敲除小鼠（Rorc^CreRunx3^fl/fl和Vav1^CreRunx3^fl/fl），他們進一步證實RUNX3對于ILC3s中RORγt的表達和維持，以及RORγt⁺APCs的發(fā)育至關(guān)重要。

CNS11內(nèi)的MAF識別元件對RORγt⁺γδT細胞和RORγt⁺T_reg細胞的發(fā)育至關(guān)重要：除了RORE和RXRE，CNS11-3內(nèi)還存在一個MAF識別元件（MARE）。類似的體內(nèi)基因編輯實驗表明，突變MARE會嚴重損害RORγt⁺γδT細胞和RORγt⁺T_reg細胞的發(fā)育，但對ILC3s和T_H17細胞影響甚微。在Il7r^CreMaf^fl/fl小鼠中的驗證也支持c-MAF通過此位點調(diào)控上述細胞。

研究結(jié)論與討論：本研究系統(tǒng)性地揭示并證實了保守非編碼序列CNS11是Rorc基因轉(zhuǎn)錄的主控區(qū)域。它如同一個指揮中心，通過整合不同的轉(zhuǎn)錄因子信號，以細胞類型特異性的方式精確調(diào)控RORγt的表達：在ILC3s等固有免疫細胞中，CNS11是發(fā)育程序啟動的“鑰匙”，需要與RUNX3等先鋒因子協(xié)同打開Rorc表達的大門；在T_H17等適應(yīng)性免疫細胞中，CNS11則是長期維持細胞身份的“穩(wěn)定器”，主要通過RORγt自身的正向反饋環(huán)路來鞏固其表達。此外，c-MAF則通過結(jié)合CNS11上的特定位點，專門調(diào)控RORγt⁺γδT和T_reg細胞的命運。

這項研究的重要意義在于，它首次在遺傳學和機制層面完整闡述了單個順式調(diào)控元件（CNS11）如何作為核心樞紐，協(xié)調(diào)不同轉(zhuǎn)錄因子（RORγt、RUNX3、c-MAF），從而差異化地調(diào)控同一關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）在不同淋巴細胞亞群中的表達。這不僅填補了17型免疫細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵空白，深化了我們對免疫細胞分化和功能可塑性的理解，也為未來針對此類細胞異�；罨�相關(guān)的疾�。ㄈ缍喟l(fā)性硬化、炎癥性腸病、銀屑病等）提供了新的潛在治療靶點。通過干預(yù)CNS11或其結(jié)合的特定轉(zhuǎn)錄因子，或許能夠更精準地調(diào)節(jié)特定類型的17型免疫反應(yīng)，從而在抑制病理反應(yīng)的同時，保留有益的免疫保護功能。