在疫苗研發領域，b型流感嗜血桿菌（Hib）是一個令人警惕的名字。這種革蘭氏陰性細菌通常寄居在人的鼻咽部，但對于嬰幼兒和免疫功能低下者，它可能突破防線，引發腦膜炎、肺炎、敗血癥等嚴重甚至致命的侵襲性疾病。得益于Hib多糖結合疫苗在全球范圍內的廣泛應用，相關疾病的發病率已大幅下降。然而，傳統的疫苗生產方式依賴于從細菌培養物中提取天然的莢膜多糖（CPS），這種多糖結構復雜、不均一，給大規模生產和嚴格的質量控制帶來了持續挑戰。此外，疫苗覆蓋不均衡、Hib感染偶有爆發以及耐藥菌株的出現，都呼喚著新一代更精準、更可控的疫苗技術。

問題的核心在于，我們能否像設計一把精準的鑰匙一樣，找到并合成出Hib細菌莢膜多糖上真正能激發有效保護性免疫反應的那個關鍵“鎖孔”——即免疫原性表位？這正是本研究希望解答的科學問題。研究人員的目標是開發一種基于明確化學結構的半合成糖綴合物疫苗，以克服傳統疫苗的缺陷。相關研究成果發表在國際知名期刊《SCIENCE ADVANCES》上。

為了達成這一目標，研究團隊運用了多項關鍵技術。在化學合成方面，他們基于磷酸酰胺化學發展了一種模塊化合成策略，高效制備了1到12個重復單元長度、結構均一的Hib莢膜多糖相關寡糖片段，這些片段帶有與已上市疫苗Quimi-Hib相同的連接臂。在免疫學篩選與評價方面，他們利用糖微陣列技術對合成寡糖庫進行抗原性高通量篩選；將篩選出的候選寡糖與載體蛋白（如破傷風類毒素TT）通過硫醇-馬來酰亞胺點擊化學進行偶聯，制備糖綴合物；通過動物（新西蘭兔和BALB/c小鼠）免疫實驗，系統評估了糖綴合物誘導的體液免疫（酶聯免疫吸附測定ELISA檢測IgG/IgM及亞類、血清殺菌試驗SBA）和細胞免疫反應（流式細胞術分析T細胞亞群及細胞因子）；并創新性地采用小鼠膿毒癥感染模型，結合活體顯微鏡成像技術，直觀、定量地評估了抗體介導的病原體從血液循環到肝臟庫普弗細胞和肝竇內皮細胞的捕獲與清除過程，從而綜合評價疫苗的保護效力。

研究人員成功設計并優化了一條基于磷酸酰胺方法的模塊化合成路線。他們合成了關鍵的單體糖苷磷酸酰胺砌塊13和二聚體砌塊17，并優化了連接反應條件（使用N-PhIMT/TBHP體系）和脫保護條件（使用BF₃·Et₂O高效去除MMTr基團）。以此為基礎，他們從帶有連接臂的二聚體受體21出發，通過交替與單體砌塊13或二聚體砌塊17進行偶聯延伸，最終高效合成了1-12聚體（1至12）的Hib莢膜多糖相關寡糖，為后續研究提供了結構明確的化合物庫。

將合成的系列寡糖打印在微陣列芯片上，用抗Hib CPS或CPS-TT的免疫兔血清進行探測。結果顯示，所有合成片段均能被抗體識別，其中二聚體2、四聚體4、六聚體6、十一聚體11和十二聚體12表現出較強的抗原性。二聚體2是能被識別的最小結構單元，這與前人研究一致。

基于微陣列結果，研究人員選擇四聚體4、六聚體6、八聚體8、十一聚體11和十二聚體12與TT蛋白偶聯，制備成糖綴合物，并免疫新西蘭兔。ELISA結果顯示，所有糖綴合物均能誘導特異性的體液免疫反應，其中4-TT誘導的IgG抗體水平最高，甚至顯著高于已上市的Hib疫苗（MINHAI Hib）陽性對照組。流式細胞術和血清殺菌試驗進一步證實，4-TT免疫血清對Hib細菌的結合親和力與殺菌活性最強。糖微陣列分析還發現，針對已上市疫苗的抗體與四聚體4的結合力最強，提示四聚體是關鍵的免疫原性表位。

研究人員進一步優化疫苗配方。在載體蛋白選擇上，比較了TT和CRM197，發現4-TT誘導的免疫反應更強。在佐劑和劑量方面，發現添加鋁佐劑（Alum）的4-TT能更快、更強地激發抗體反應；然而，不使用任何佐劑的4-TT（無論5μg還是20μg糖劑量）所誘導的免疫反應水平與已上市疫苗相當，表明其在不依賴佐劑的情況下即可達到平臺效應。這為開發無佐劑疫苗配方提供了可能。

在BALB/c小鼠模型中評估4-TT的免疫特性。結果顯示，無佐劑的4-TT能誘導與已上市疫苗水平相當的特異性IgG、IgM及其各亞類（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）抗體，表明其能有效引發抗體的類別轉換。流式細胞術分析顯示，4-TT能顯著激活脾臟中的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T細胞，并能促進CD4⁺T細胞在病原體刺激下產生干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4），誘導了混合的T_H1和T_H2型免疫應答。這證明4-TT能有效激發與已上市疫苗類似的體液和細胞免疫反應。

通過一個創新性的疫苗評價系統，研究人員在活體層面直觀研究了4-TT免疫血清的保護機制。將Hib細菌與不同免疫血清預孵育后靜脈注入小鼠，發現4-TT、4-TT+Alum及已上市疫苗的免疫血清均能高效、快速地將血液中的細菌清除，并主要捕獲至肝臟。活體顯微鏡成像進一步揭示，這些高效價血清能顯著促進肝臟竇腔中的庫普弗細胞和肝竇內皮細胞對循環細菌的捕獲，而無佐劑的4-TT血清在此方面的效力與已上市疫苗血清無顯著差異。這從機理上證實了4-TT糖綴合物具有強大的體內保護效能。

本研究通過系統的化學合成與免疫學評價，成功從Hib莢膜多糖的1-12聚體庫中篩選出四聚體（4）為關鍵的免疫原性表位。將其與破傷風類毒素（TT）偶聯制備的無佐劑糖綴合物疫苗候選物4-TT，在臨床前研究中展現出卓越的性能：它能誘導與已上市多糖疫苗效力相當的、強大的體液與細胞免疫反應；其免疫血清具有高結合活性和血清殺菌能力；更重要的是，在模擬人體清除病原體機制的小鼠膿毒癥感染模型中，4-TT免疫血清能高效介導肝臟免疫細胞捕獲并清除血液循環中的細菌，其保護效力與已上市疫苗相當。

這項研究的意義重大。首先，它明確了Hib疫苗的最小高效免疫表位，為基于理性設計的下一代疫苗開發提供了精確的分子藍圖。其次，它驗證了基于磷酸酰胺化學的模塊化合成策略可用于大規模生產結構明確的糖類抗原，解決了傳統多糖疫苗生產中的異質性問題，使生產工藝更簡化、質量更可控。最后，研究結果表明，這種無佐劑的、結構明確的半合成糖綴合物疫苗在臨床前研究中達到了與現有疫苗非劣效的效果，為推進其進入臨床試驗奠定了堅實的科學基礎，有望為全球，特別是疫苗生產和質量控制面臨挑戰的地區，提供一種更優的Hib疾病預防選擇。