摘要

背景

微小RNA（miRNA）是基因表達的關鍵轉錄后調節(jié)因子，可作為多種疾病（包括癌癥）早期診斷和預后的重要生物標志物。然而，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法通常涉及復雜的探針設計、多步驟反應以及有限的多重檢測能力。

結果

在本研究中，我們開發(fā)了一種無標記、等溫的多重miRNA檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)結合了自啟動發(fā)夾探針和熒光激活適配體（FLAPs）的轉錄技術。每個發(fā)夾探針編碼一個針對特定miRNA的FLAP序列，在識別目標miRNA后，通過T7 RNA聚合酶介導的轉錄過程產(chǎn)生熒光信號。該方法能夠靈敏且選擇性地檢測三種目標miRNA（miR-21、miR-141和let-7d），檢測限可低至皮摩爾級別。通過使用FLAP-熒光團對，實現(xiàn)了高效的多重檢測，同時減少了光譜干擾。

意義

所開發(fā)的方法使用細胞來源的RNA提取物，在癌細胞系和正常細胞系中重現(xiàn)了預期的miR-21差異表達模式，結果與干細胞環(huán)RT-qPCR結果一致。值得注意的是，該方法每個目標miRNA僅需要一個發(fā)夾探針，并且采用無標記格式進行檢測，從而簡化了多重檢測過程，減少了相互干擾。這一平臺為生物分析和診斷領域中的高效miRNA分析提供了實用途徑。

引言

微小RNA（miRNA）是長度通常在18到25個核苷酸之間的單鏈RNA分子，在基因表達的轉錄后調控中起著關鍵作用。miRNA存在于各種真核生物中（包括植物和動物），通過與互補的信使RNA（mRNA）結合來調節(jié)多種生物過程，從而實現(xiàn)基因沉默[1]、[2]、[3]。由于其調控功能，miRNA在人類疾病中的關鍵作用日益受到重視。過去二十年的研究表明，miRNA表達的失調常與多種疾病相關，尤其是癌癥和心血管疾病[4]、[5]。血液和細胞樣本中miRNA的異常表達模式表明它們作為疾病診斷和預后的有前景的生物標志物具有巨大潛力[1]、[4]、[5]。在乳腺癌中，幾種miRNA表現(xiàn)出差異表達模式；特定miRNA（如miRNA-21、miRNA-10b、miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-155和miRNA-191）表達上調，而其他miRNA（如miRNA-7、miRNA-17p、miRNA-27b、miRNA-143和miRNA-139）表達下調[6]、[7]。其中，miRNA-21與乳腺癌的關聯(lián)尤為密切，這突顯了其作為癌癥診斷和預后重要生物標志物的潛力[7]、[8]。 目前，干細胞環(huán)逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）被認為是miRNA檢測的金標準[9]。盡管這種方法對目標miRNA具有高靈敏度和特異性，但也存在一些局限性，例如需要熱循環(huán)儀進行擴增、由于多個引物和探針之間的交叉雜交而限制了多重檢測能力，以及使用熒光團/淬滅劑標記的TaqMan或分子信標探針的成本較高。為了解決這些問題，人們開發(fā)了多種先進的檢測策略，如電化學發(fā)光（ECL）[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、熒光測定[18]、[19]、[20]、[21]、[22]和比色法[23]、[24]、[25]、[26]等技術，這些方法雖然靈敏度高，但仍需要復雜的預反應步驟、復雜的探針修飾以及需要與每個目標特異性結合的多探針設計。 熒光激活適配體（FLAPs）是一種特殊的RNA序列，能夠特異性結合熒光團，在結合時激活熒光[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。這些熒光團在未結合時幾乎不發(fā)光，但與FLAPs結合后會產(chǎn)生強熒光，使其在生物傳感應用中非常有效。這一獨特性質促進了利用FLAPs作為信號組分的生物傳感器的開發(fā)，實現(xiàn)了多種分析物的靈敏檢測[19]、[20]、[32]、[33]、[34]、[35]。此外，基于FLAP的適配體傳感器通過使用多個FLAP-熒光團對實現(xiàn)多重檢測，覆蓋整個可見光譜范圍，從而無需使用傳統(tǒng)的雙標記探針[19]、[34]、[36]、[37]、[38]。 在本研究中，我們旨在通過將FLAPs與針對每個目標miRNA的獨特自啟動發(fā)夾探針結合，建立一種新的多重miRNA檢測方法。利用這種方法，我們同時以高靈敏度和特異性檢測了三種目標miRNA（miR-21、miR-141和let-7d），并且成功測定了不同癌細胞系中的miRNA含量，其結果與標準干細胞環(huán)RT-qPCR的結果高度一致。該方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的局限性，無需復雜的探針設計，同時提供了一個適用于檢測多種miRNA的通用平臺。

材料

本研究中使用的所有DNA序列（表S1）和無核酸酶的水均購自Integrated DNA Technology Inc.（美國愛荷華州科拉爾維爾）。10× T7 RNA聚合酶緩沖液、T7 RNA聚合酶、RNase抑制劑和DNA聚合酶I（Klenow片段，exo-）購自Enzynomics（韓國大田）。NTP、dNTP Mix和10000× SYBR Gold核酸凝膠染色劑購自Thermo Fisher Scientific（美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。HBC620購自GlpBio Technology（美國加利福尼亞州蒙特克萊爾）。

miRNA檢測系統(tǒng)的總體原理

如圖1所示，所開發(fā)的方法基于目標miRNA與單個發(fā)夾探針之間的相互作用。目標miRNA與發(fā)夾探針的環(huán)區(qū)互補雜交，逐漸解旋至莖區(qū)。結合后，目標miRNA暴露出莖區(qū)內的自啟動區(qū)域，該區(qū)域隨后與3′端的趾部序列雜交，從而啟動Klenow片段的DNA聚合反應。

結論

總之，我們開發(fā)了一種基于自啟動發(fā)夾探針的多重miRNA檢測方法，這些探針編碼由T7 RNA聚合酶轉錄的熒光激活適配體（FLAPs）。該策略在等溫條件下實現(xiàn)靈敏且選擇性的檢測，通過FLAP-熒光團對實現(xiàn)多重檢測，且光譜干擾最小。由于探針無標記，無需熒光團或淬滅劑修飾，因此檢測設計更加簡潔。

CRediT作者貢獻聲明

Jun Ki Ahn：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、資源協(xié)調、項目管理、資金獲取。 Hyogu Han：撰寫 – 初稿撰寫、驗證、方法學設計、實驗研究、數(shù)據(jù)分析、概念構思。 Jieun Yang：驗證、方法學設計、數(shù)據(jù)分析。 Hyo Won Jeon：驗證、方法學設計、數(shù)據(jù)分析。 Chang Yeol Lee：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、項目管理。

利益沖突聲明

作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。

致謝

本研究得到了韓國貿(mào)易、工業(yè)和能源部（MOTIE）資助的“技術創(chuàng)新計劃”（開發(fā)用于超靈敏和快速多重診斷呼吸道感染的完全集成電化學微流控系統(tǒng)，項目編號RS-2024-00400234）的支持。