《Analytica Chimica Acta》：“IEDDA”-activated Fluorescent Sensing for Protein Cysteine Redox Modifications Profiling
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背景：蛋白質半胱氨酸氧化修飾（如硫醇和硫羧酸）在氧化應激和疾病中起關鍵作用，但現有熒光探針存在背景高、動態追蹤能力不足的問題。目的：開發背景消除的“開-關”熒光探針系統。方法：設計BCN-SH和BCN-SOH探針，利用逆電子需求Diels-Alder（IEDDA）反應與BODIPY-tetrazine結合，實現硫醇/硫羧酸的特異性檢測。結果：探針在活細胞和線蟲中實現高靈敏度、低背景的實時動態追蹤，熒光強度提升248倍。意義：為氧化生物學研究提供新型工具，突破傳統“常亮”探針的局限。
陳林峰|鄭一夫|王紫怡|王天陽|文欣|王慧玲|劉春榮
國家綠色農藥重點實驗室，華中師范大學化學學院，智能生物傳感技術與健康國際聯合研究中心，中國武漢，430079
摘要
背景
蛋白質半胱氨酸的磺酰化是一種在氧化還原信號傳導和疾病病理學中起關鍵作用的可逆修飾。然而，全面監測這些事件仍然具有挑戰性，因為大多數現有的“始終開啟”熒光探針存在高背景信號的問題，并且缺乏在活體系統中進行動態、實時跟蹤的能力。
結果
在這里，我們開發了一種基于逆電子需求Diels–Alder（IEDDA）反應的無背景“開啟”傳感策略。我們設計了選擇性探針BCN-SH和BCN-SOH，分別用于標記蛋白質巰基和磺酸，通過引入一個雙環[6.1.0]壬-4-炔（BCN）結構來實現這一目標。隨后與基于四嗪的熒光團BODIPY-tetrazine（BTZ）的反應可引發248倍的熒光增強，從而實現高對比度檢測。這些探針表現出優異的選擇性和穩定性，成功地在氧化應激下的活體HeLa細胞中可視化了內源性半胱氨酸的氧化還原動態。此外，我們將這一策略擴展到了秀麗隱桿線蟲中的熒光成像。
意義
將選擇性的半胱氨酸化學與熒光生物正交激活相結合，該平臺實現了無背景、時間分辨的動態氧化還原事件的可視化。這一策略擴展了氧化還原生物學的化學工具箱，有助于對氧化信號傳導的機制進行研究。
引言
活性氧（ROS）作為重要的信號分子和細胞代謝的副產物，通過氧化修飾在調節蛋白質功能中發揮關鍵作用[1]。因此，基于氧化還原的蛋白質修飾（PTMs）已成為細胞在不同生理條件下調節蛋白質活性和維持信號傳導的重要機制。半胱氨酸殘基具有親核性的巰基側鏈，特別容易受到氧化還原修飾的影響，這種修飾通過改變各種氧化狀態來調節蛋白質的結構和活性。這些氧化還原修飾通常是可逆的，使蛋白質能夠動態響應細胞環境的變化，尤其是在氧化應激條件下[2]，因此在細胞信號傳導[3]、調節[4]和疾病發病機制[5]、[6]中起著關鍵作用。鑒于半胱氨酸的生物學重要性，過去幾十年中開發出了大量的化學方法和熒光探針，用于選擇性地檢測和監測生物系統中的游離半胱氨酸巰基[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。同時，這些化學基礎促進了先進的定量蛋白質組學的快速發展，使得能夠對整個蛋白質組的半胱氨酸反應性和氧化還原狀態進行 profiling[12]、[13]、[14]。
在半胱氨酸的各種氧化狀態中，磺酸（Cys-SOH）占據了一個獨特的中間體位置[15]、[16]。當暴露于ROS時，半胱氨酸巰基容易被氧化成磺酸，后者作為進一步氧化還原轉化的分支點。根據局部環境和細胞氧化還原平衡的不同，Cys-SOH可以轉化為二硫化物、磺酰胺或亞砜衍生物[17]、[18]。與更高的氧化狀態（如磺酸）不同，磺酸通常是可逆的，因此它充當了一個動態的分子開關，將氧化還原信號傳導與蛋白質調節整合在一起[19]、[20]。這種短暫且反應性的特性使其在依賴于快速和可逆巰基氧化的途徑中發揮關鍵生物學作用。
鑒于蛋白質磺酰化的生物學重要性，人們投入了大量努力來開發用于其檢測的化學工具[21]。Allison的早期研究表明，dimedone可以用來選擇性地捕獲蛋白質磺酸[22]。Furdui及其同事進一步引入了基于1,3-環戊二酮的探針，這些探針對磺酸的選擇性得到了增強[23]、[24]。Carroll及其同事隨后對碳中心親核試劑的結構-反應性關系進行了系統研究，并開發了一系列磺酸探針，包括DAz-1 [20]、[25]、DAz-2 [26]和BTD [23]，這些探針在生理條件下對磺酸的選擇性和反應性得到了進一步改進。此外，Poole小組和Benkovic小組分別報道了7-氯-4-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑（NBD-Cl）和芳基硼酸衍生物作為標記蛋白質磺酸的探針[27]、[28]。最近，新一代探針如WYneN被開發出來，以進一步提高在復雜生物環境中的標記效率和動力學特性[29]。這些探針為半胱氨酸氧化還原生物學提供了寶貴的見解，使得能夠在蛋白質組水平上研究蛋白質磺酰化，并有助于表征氧化還原調控的信號通路[30]、[31]、[32]。同時，熒光團共軛探針能夠直接可視化活體細胞中的磺酸動態，實現具有空間和時間分辨率的氧化還原變化的實時監測[25]、[26]、[33]。然而，大多數報道的熒光磺酸探針依賴于“始終開啟”的熒光團設計，這會導致高背景信號，并限制了定量或動態研究的適用性。為了克服這些限制，需要新的化學策略，將高選擇性與報告動態氧化還原變化的能力結合起來。
Weissleder及其同事首次發現四嗪基團可以暫時抑制熒光團的發射，這種抑制可以通過與TCO的逆電子需求Diels–Alder（IEDDA）反應來恢復[34]。基于這一概念，Devaraj小組和Wu小組隨后開展了一系列研究，擴展了基于四嗪的熒光探針的應用范圍[35]、[36]、[37]、[38]、[39]（圖1A）。受此方法的啟發，我們將高度選擇性的半胱氨酸和亞砜共軛化學與IEDDA觸發的熒光“開啟”策略相結合，開發了一種能夠在活細胞中成像蛋白質半胱氨酸氧化修飾的“IEDDA”激活協議（圖1B）。這些探針在水介質中表現出優異的選擇性、快速的動力學和高穩定性，能夠分別高效地標記蛋白質、細胞和生物體水平的巰基和亞砜。值得注意的是，我們觀察到熒光強度的變化與活細胞中的氧化刺激密切相關，從而實現了對細胞內蛋白質半胱氨酸殘基氧化還原變化的實時監測。總體而言，這項研究不僅擴展了基于熒光的化學探針的種類，還為研究氧化應激和ROS信號傳導中半胱氨酸氧化修飾的動態作用提供了一個強大的平臺。與傳統的“始終開啟”探針不同，這種IEDDA激活策略通過其選擇性的熒光開啟機制顯著降低了背景信號，從而確保了高對比度的成像分辨率。
材料與通用實驗方法
所有化學試劑均從商業供應商處購買，包括中國醫藥化學試劑有限公司和Aladdin試劑有限公司，使用前無需進一步純化。熒光光譜是在熒光分光光度計（Agilent Cary Eclipse）上記錄的。凝膠熒光成像使用FluorChem R化學發光成像系統（ProteinSimple）進行。圖像分析是在激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5X）上完成的。HPLC分析則
“IEDDA”激活熒光探針的設計與合成
如上所述，我們的標記策略包括將四嗪基團連接到熒光團以抑制其熒光，將一個張力的二烯ophile連接到能夠選擇性識別半胱氨酸巰基或磺酸的化學探針上，并通過EDG與四嗪的“IEDDA”反應來觸發熒光響應。在Wu及其同事之前的工作中，將四嗪基團連接到基于BODIPY的熒光團（BTZ）上會暫時抑制其熒光，然后通過
結論
總之，我們開發了一種“IEDDA”激活的熒光標記平臺，用于檢測蛋白質半胱氨酸巰基和磺酸，通過將BCN作為BTZ的穩定激活劑與兩種選擇性探針BCN-SH和BCN-SOH結合來實現。這些探針在生理條件下表現出高穩定性、反應性和選擇性。它們的性能在體外模型蛋白和細胞裂解物中得到了驗證，并擴展到了活細胞成像，并進一步應用于模型生物C. elegans中，
CRediT作者貢獻聲明
劉春榮：撰寫 – 審稿與編輯、監督、資源獲取、方法學、資金獲取、數據管理、概念化。王紫怡：撰寫 – 審稿與編輯、驗證、實驗。王天陽：撰寫 – 審稿與編輯、驗證。文欣：撰寫 – 審稿與編輯、驗證。王慧玲：撰寫 – 審稿與編輯、驗證。鄭一夫：撰寫 – 審稿與編輯、可視化、驗證、方法學、實驗。陳林峰：撰寫 – 原始草稿，
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
本工作得到了NSFC（22077045）的支持。
