《Analytica Chimica Acta》：Precise, Fast, and Automated Gel Quantification Powered by YOLO11 Instance Segmentation
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基于YOLO11n的自動化凝膠電泳分析框架實現了像素級分割，解決了傳統方法依賴幾何假設和人工干預的局限性，在保持高精度的同時（R2=0.9964，CV=3.3%）將處理速度提升至秒級。
Youli Tian|Weichen Ji|Luobing Wang|Weiwen Liu|Qiang Zhang|Yuxing Wang|Chengxi Cao
上海交通大學自動化與智能感知學院，中國上海200240
摘要
背景
凝膠電泳是分析化學和蛋白質組學的核心技術，但下游的圖像分析仍是一個瓶頸，受到人工勞動和主觀性的限制。傳統的基于輪廓的密度測量依賴于嚴格的泳道劃分和幾何假設，這使得它容易受到諸如泳道變形、微笑效應和復雜背景等常見偽影的影響。盡管深度學習提供了自動化的潛力，但現有的解決方案往往缺乏精確的量化能力或需要大量的預處理。為了解決這些限制，我們提出了一個基于輕量級YOLO11n架構的端到端、完全自動化的條帶分割框架。
結果
該模型在150張內在熒光成像圖像上進行了訓練，并在一個小型異構數據集（n=50）上進行了微調，利用遷移學習策略確保了Coomassie Brilliant Blue、銀染色和熒光染色的兼容性。通過處理高分辨率輸入（1280像素）而無需預處理，YOLO11-Seg模型的分割mAP50達到了0.947，且延遲時間僅為3.1毫秒，顯著優于U-Net和基于輪廓的方法在分辨微弱和變形條帶方面的表現。關鍵的是，該方法使用像素級掩碼而不是邊界框進行量化，有效地排除了背景噪聲。該方法顯示了積分強度與蛋白質濃度之間的優異線性（R2=0.9964），并且變異性較低（CV低至3.3%）。將其集成到自定義的“Seg Lab”軟件中后，每個凝膠的分析和可視化時間從4分鐘（手動工作流程）縮短到了約1秒。
意義
本研究提出了一種穩健、客觀且高通量的替代傳統密度測量的方法。通過消除對泳道劃分和人工干預的依賴，該框架解決了分析速度和量化精度之間的長期矛盾。其輕量級設計和經過驗證的跨染色通用性使其成為常規大規模蛋白質組學和分析化學工作流程中的實用且易于使用的工具。
引言
凝膠電泳仍然是分析化學和蛋白質組學中用于分離、鑒定和純化大分子的基石技術[1]。各種可視化化學方法——如Coomassie Brilliant Blue（CBB）、銀染色和熒光染料——將分離結果轉換為凝膠圖像，從而為生物學解釋和定量分析提供基礎[2]、[3]、[4]、[5]。雖然濕實驗室協議高度標準化，但從凝膠圖像中提取定量信息仍然是主要瓶頸。實際上，條帶檢測和量化通常通過手動注釋或半自動化軟件進行，這引入了主觀性，限制了通量，并成為現代大規模研究的關鍵限制。
為了減輕人工勞動，已經開發了幾種自動化的條帶檢測方法[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。大多數傳統流程依賴于沿凝膠圖像的x軸和/或y軸投影的強度輪廓，然后應用基于規則的啟發式方法來定位泳道和條帶。這種密度測量范式隱含地假設了直泳道和大致水平的條帶，而這經常被真實的電泳偽影（例如微笑效應、泳道彎曲和局部變形）所打破。在這種非理想條件下，從投影輪廓派生的剛性矩形感興趣區域（ROI）可能不符合真實的條帶形態，導致信號截斷或背景污染。盡管存在幾何校正和泳道跟蹤算法，但它們通常需要針對圖像進行參數調整和用戶干預，從而削弱了自動化并重新引入了主觀性[11]、[12]、[13]。此外，低信噪比（SNR）數據和復雜背景通常需要預處理（背景減除、濾波等）來穩定輪廓分析。這些步驟可能會扭曲潛在的強度分布——特別是對于微弱、對比度低的條帶——從而影響量化準確性并增加假陰性的風險[14]、[15]。最后，基于輪廓的方法缺乏語義選擇性，可能會將氣泡、裂紋、灰塵或染色斑點誤分類為真正的蛋白質條帶，進一步降低準確性。這些限制促使人們開發出無需泳道劃分或強幾何假設的像素級、形態感知的方法。
深度學習（DL），特別是卷積神經網絡（CNN），最近成為分析化學中復雜圖像任務（包括分割和量化）的基于輪廓、規則驅動的凝膠分析的有吸引力的替代方案[16]、[17]、[18]。與依賴于直泳道和水平條帶的投影/密度測量流程不同，實例分割可以直接從像素中劃分每個條帶，并在偽影（例如微笑效應、擴散、彎曲）破壞幾何假設的情況下保持其真實形態。與此優勢一致，基于DL的分割在相關生物圖像應用中表現出強大的魯棒性，例如用于彗星試驗分析的全卷積網絡、用于dPCR圖像處理的Mask R-CNN以及用于熒光顯微鏡核分割的混合檢測-分割策略[19]、[20]、[21]。總體而言，這些研究表明DL模型可以直接從原始數據中學習出有區分性的表示，并且通常比手工制作的流程更能容忍噪聲、不均勻背景和復雜結構——使它們非常適合處理具有挑戰性的凝膠圖像。
受到基于輪廓的密度測量局限性和DL分割優勢的啟發，我們提出了一個基于最先進的YOLO11實例分割架構的端到端條帶分析框架[22]。我們對各種YOLO版本和模型規模進行了系統評估，并確定高分辨率輸入（1280像素）對于分辨微量蛋白質條帶至關重要。為了平衡靈敏度和速度，我們發現輕量級的YOLO11n（Nano）架構提供了最佳的折中方案。我們的基準測試表明，這種精簡的架構在提取條帶特征的同時，減少了大型模型在有限凝膠數據集上過擬合的風險。所得模型直接從原始凝膠中分割條帶，無需泳道劃分，并通過分割后的強度積分支持定量讀數。我們進一步通過使用涵蓋多種染色模式的小型額外數據集進行微調來證明其通用性。總體而言，這項工作旨在為蛋白質組學和分析化學中的凝膠圖像分析提供更快、更客觀和更穩健的解決方案。
實驗和方法
化學試劑。30%的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺（Acr-Bis，29:1）溶液、甘氨酸（Gly）、牛血清白蛋白（BSA）、TrueColor?雙色預染蛋白質標記物（10–180 kDa）和非預染蛋白質標記物（14.4–116.0 kDa），以及BeyoGel? Plus預制PAGE凝膠（Tris-Gly，4%–20%梯度，10孔）均來自上海比云天生物技術有限公司（中國上海）。過硫酸銨（APS）、四甲基乙烯二胺（TEMED）、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）等。
設備和實驗
提出的工作流程和架構。本研究的整體框架如圖1所示，包括兩個不同的階段：模型開發流程（圖1A）和端到端推理工作流程（圖1B）。如圖1A所示，開發過程從圖像采集開始，直接從IFI-PAGE設備捕獲原始IFI凝膠圖像。為了監督深度學習模型，我們建立了一個嚴格的標記過程：專家化學家手動注釋了
模型選擇和性能評估
我們選擇了分割后的強度積分，以最小化與基于幀的量化相關的系統誤差。如補充圖S1所示，基于ROI的積分不可避免地會將背景噪聲和非特異性染色計為信號，這可能會主導弱條帶的測量強度。基于掩碼的積分將測量限制在條帶像素上，從而提高了準確性和魯棒性，特別是對于低強度條帶。
為了確定最佳
討論
本研究表明，YOLO11-Seg通過用像素級條帶掩碼替代依賴于泳道/輪廓的程序，實現了更穩健的凝膠量化工作流程。與基于ROI/幀的積分相比，基于掩碼的積分更好地抑制了背景污染——特別是對于弱條帶——因為它將強度總和限制在條帶像素上，而不是混合周圍的噪聲。從定量上看，自動化結果與基于ImageJ的測量結果高度一致
結論
本研究介紹了一個基于輕量級YOLO11n架構的穩健、端到端的凝膠分析框架，它用精確的像素級實例分割替代了傳統的依賴于泳道的密度測量。通過嚴格排除背景偽影，該方法實現了出色的校準線性（R2=0.9964），顯著優于手動工作流程。借助遷移學習策略實現跨染色的兼容性，并部署在用戶友好的“Seg Lab”軟件中，
CRediT作者貢獻聲明
Qiang Zhang：撰寫——審閱與編輯、驗證、監督、軟件、資源。Yuxing Wang：撰寫——審閱與編輯、可視化、驗證、軟件、形式分析、概念化。Weiwen Liu：驗證、軟件、方法學、調查、形式分析。Youli Tian：撰寫——原始草稿、驗證、項目管理、方法學、調查、資金獲取、形式分析、數據管理、概念化。Weichen Ji：撰寫——原始草稿，
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
致謝
我們感謝國家自然科學基金（批準編號：22574099、22104082和22074091）、中國國家生物制藥技術創新中心的“開放競爭選拔最佳候選人”關鍵技術計劃（授權編號：NCTIB2023XB03002）以及CPSF的博士后獎學金計劃（批準編號：GZC20241027）的財政支持。
