《Aquaculture》：Application of ultrasound-based maturational status assessment in the management of female rainbow trout broodstock
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本研究通過每周超聲成像監(jiān)測虹鱒魚卵成熟度，發(fā)現(xiàn)部分或完全黑化的卵母細(xì)胞預(yù)示下周排卵，并證實(shí)超聲技術(shù)可優(yōu)化卵剝離時間，提升卵質(zhì)量，減少胚胎損失。
格雷戈里·M·韋伯（Gregory M. Weber）| 盧克·R·伊瓦諾維奇（Luke R. Iwanowicz）| 馬克·A·霍斯圖特勒（Mark A. Hostuttler）| 吉爾·E·伯基特（Jill E. Birkett）| 蒂莫西·D·利茲（Timothy D. Leeds）
美國農(nóng)業(yè)部，農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局，國家冷水與冷水養(yǎng)殖中心，美國西弗吉尼亞州基爾尼斯維爾（US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, National Center for Cool and Cold Water Aquaculture, Kearneysville, WV, USA）
摘要
本研究評估了每周使用超聲波成像技術(shù)來提高卵子質(zhì)量并預(yù)測雌性虹鱒（Oncorhynchus mykiss）排卵時間的效果。當(dāng)鮭科魚類接近產(chǎn)卵期并開始卵子成熟時，由于細(xì)胞質(zhì)清透明化，卵子的回聲特性會降低。這導(dǎo)致超聲圖像從淺灰色迅速變?yōu)楹谏Ｔ谄邆�產(chǎn)卵季節(jié)中，研究人員每周對卵子的回聲特性進(jìn)行了監(jiān)測，并記錄了排卵前一周處于不同成熟階段的雌性魚體內(nèi)的胚胎發(fā)育情況。超過90%的具有部分黑色或完全黑色卵子的魚在接下來的一周內(nèi)排卵。平均而言，44%的排卵魚在之前的超聲圖像中顯示有部分或完全黑色的卵子，表明它們在卵子成熟開始后大約三天內(nèi)排卵。對于每條被確定為成熟或正在成熟的雌魚，有2.40±0.10條魚在接下來的一周內(nèi)排卵（R2 = 0.83），從而能夠可靠地預(yù)測接下來的排卵率。那些在排卵前一周首次出現(xiàn)部分或完全黑色卵子的雌魚，其胚胎發(fā)育率較低（39.3±4.59%），而那些仍處于未成熟狀態(tài)（淺灰色卵子）的雌魚胚胎發(fā)育率為52.5±4.11%。未能在卵子成熟后一周內(nèi)排卵的雌魚，其卵子質(zhì)量會迅速下降。將超聲波成像技術(shù)納入孵化場的產(chǎn)卵檢查流程中，可以提供優(yōu)化卵子采集時間的信息，以最大化卵子質(zhì)量，識別產(chǎn)卵質(zhì)量較差的雌魚，并提高對親魚排卵率的短期預(yù)測能力。
引言
大多數(shù)鮭科魚類，包括虹鱒，在人工飼養(yǎng)條件下能夠排卵，但無法自行產(chǎn)卵（Bry, 1981; Aegerter and Jalabert, 2004）。因此，必須手動將排卵后的卵子從魚體內(nèi)取出。卵子質(zhì)量可能在排卵后一周內(nèi)開始下降，溫度在這一過程中起著關(guān)鍵作用（Springate et al., 1984; Aegerter and Jalabert, 2004; Samarin et al., 2008; Weber and Hostuttler, 2012）。關(guān)于排卵后卵子質(zhì)量下降的原因已受到廣泛關(guān)注（例如Rime et al., 2004; Aegerter et al., 2005; Ma et al., 2015, Ma et al., 2016）。由于卵子質(zhì)量下降的時間窗口較短，孵化場通常每周會對預(yù)期排卵的每條雌魚進(jìn)行產(chǎn)卵檢查，方法是通過對腹部施加壓力來檢查是否有可排出的卵子。由于大多數(shù)虹鱒的產(chǎn)卵季節(jié)持續(xù)約三個月，因此需要在整個季節(jié)內(nèi)多次處理這些魚（Weber et al., 2023）。這對孵化場工作人員來說工作量很大，也對魚本身造成壓力。如果未能在卵子成熟后一周內(nèi)識別出已經(jīng)排卵的雌魚，不僅會導(dǎo)致可存活胚胎的丟失，未受精或未發(fā)育的卵子還會成為細(xì)菌和真菌滋生的溫床。虹鱒卵在孵化前通常會被送往育苗場，在這個階段稱為“胚胎發(fā)育期”（Weber et al., 2016）。在胚胎發(fā)育期去除死亡或發(fā)育不良的卵子和胚胎同樣需要大量人力。目前的產(chǎn)卵檢查程序僅限于每周觀察是否有可排出的卵子，這些信息對于提高卵子質(zhì)量或可靠預(yù)測近期排卵率幫助不大。
超聲波成像分析已被用于多種物種，以測量生殖腺和卵泡的大小、確定性別以及估計生殖腺的成熟階段（Mattson, 1991; Novelo and Tiersch, 2012; Hliwa et al., 2014; Naeve et al., 2018）。鮭科魚類的卵子在不同發(fā)育階段具有不同的聲學(xué)特性或回聲特性（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004; Segret et al., 2022）。未成熟的卵子具有高回聲特性，因此在超聲圖像中呈現(xiàn)為淺灰色至白色。排卵前的雌魚卵膜具有高回聲，但卵子內(nèi)容物呈低回聲或無回聲。在超聲圖像中，這表現(xiàn)為被亮環(huán)包圍的黑色卵子（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004）。從高回聲到無回聲的轉(zhuǎn)變是由于卵子成熟過程中細(xì)胞質(zhì)的變化。在卵子生長的大部分時間里，包括卵黃生成階段，卵子都處于減數(shù)分裂I期的停滯狀態(tài)。卵黃生成后，促性腺激素的增加以及成熟誘導(dǎo)激素17α,20β-二羥基-4-孕烷-3-酮的產(chǎn)生會導(dǎo)致卵子成熟并最終排卵（Nagahama, 1997）。卵子成熟包括核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟。核成熟涉及卵子核或生殖泡的變化，這與減數(shù)分裂的重新啟動有關(guān)。細(xì)胞質(zhì)成熟包括膜結(jié)合的卵黃顆粒融合成中央卵黃團(tuán)以及水分的增加，這導(dǎo)致卵子細(xì)胞質(zhì)的清透明化，從而使卵子的回聲特性降低（Jalabert et al., 1978; Patino and Sullivan, 2002; Lubzens et al., 2010; Segret et al., 2022）。細(xì)胞質(zhì)的清透明化發(fā)生在卵子生殖泡分解之前，這一現(xiàn)象常被用作減數(shù)分裂重新啟動的標(biāo)志（Jalabert et al., 1978; Bry, 1981）。
由于排卵后卵子質(zhì)量會下降，因此準(zhǔn)確預(yù)測即將發(fā)生的排卵對于孵化場的卵子采集時機(jī)非常寶貴。超聲波技術(shù)可以無創(chuàng)地監(jiān)測卵子成熟的進(jìn)程，其中細(xì)胞質(zhì)成熟的跡象是卵子中心出現(xiàn)無回聲區(qū)域，并隨著細(xì)胞質(zhì)清透明化的進(jìn)展而擴(kuò)展（Segret et al., 2022）。雌性虹鱒通常在這一轉(zhuǎn)變開始后的四天內(nèi)排卵，這提供了一個無創(chuàng)的標(biāo)志，表明魚即將排卵（Scaratt, 2015; Segret et al., 2022）。此外，通過分析成熟階段還可以識別出卵子質(zhì)量較差的雌魚。最近的研究表明，在虹鱒中，從細(xì)胞質(zhì)清透明化完成到排卵的成熟階段時間會受到水質(zhì)離子含量的影響，這也會降低胚胎的發(fā)育成功率和質(zhì)量（Segret et al., 2022）。
工業(yè)界已經(jīng)采用超聲波技術(shù)進(jìn)行鮭科魚類的性別鑒定。這包括利用深度學(xué)習(xí)輔助的自動化系統(tǒng)來區(qū)分未成熟的卵子和已完成細(xì)胞質(zhì)成熟的卵子（Yari et al., 2024a, Yari et al., 2024b）。盡管對鮭科魚類卵巢進(jìn)行超聲波檢查在技術(shù)上簡單、快速且不需要高端設(shè)備，但這項技術(shù)尚未被納入常規(guī)的產(chǎn)卵檢查流程中。阻礙其廣泛應(yīng)用的一個限制是缺乏評估其在實(shí)際孵化場工作中潛在益處的研究。據(jù)我們所知，利用超聲波技術(shù)提前識別卵子質(zhì)量問題或預(yù)測多個季節(jié)的排卵率的研究仍不充分且未得到量化。此外，以往基于超聲波的研究主要針對實(shí)驗室中的少量個體或野生魚類（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004; Carim et al., 2021; Segret et al., 2022）。我們在國家冷水與冷水養(yǎng)殖中心（NCCCWA）使用超聲波技術(shù)已有十年以上，用于識別與卵子成熟相關(guān)的回聲變化，以提高選擇性育種程序的效率。在本研究中，我們利用七年間由孵化場工作人員收集的數(shù)據(jù)，評估了每周通過超聲波篩查雌性親魚來預(yù)測短期排卵率的效果，并提供可操作的信息以改善胚胎發(fā)育率。通過每周產(chǎn)卵檢查有效識別出已進(jìn)入卵子成熟階段的雌魚，有助于提高孵化場運(yùn)營和選擇性育種的效率。
實(shí)驗動物和孵化場程序
動物飼養(yǎng)程序已獲得西弗吉尼亞州利敦（Leetown, WV）的機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee）的批準(zhǔn)，符合美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局（USDA, ARS）的政策和程序130.4.v.3。研究中的動物屬于NCCCWA的選擇性育種計劃，包括2015–2025年的魚群。所有參與選擇性育種的雌魚都被納入研究。大多數(shù)雌魚在兩歲時首次產(chǎn)卵。
排卵前一周處于不同成熟階段的雌魚比例
僅對2015年和2016年的魚群分別收集了II類和III類雌魚的比例及胚胎發(fā)育率數(shù)據(jù)。從2017年開始，我們在進(jìn)行超聲波檢查時不再區(qū)分II類和III類卵子的雌魚。數(shù)據(jù)合并的部分原因是2017年我們改變了檢查方式：之前是由具有超聲波檢查經(jīng)驗的人員單獨(dú)操作，后來改為孵化場工作人員在產(chǎn)卵檢查時快速進(jìn)行掃描。
討論
價格合理的超聲波系統(tǒng)能夠提供具有足夠分辨率的實(shí)時超聲圖像，從而在排卵前三天內(nèi)識別出雌魚，這對孵化場操作和研究具有重大潛力。我們在NCCCWA多年來的每周產(chǎn)卵檢查數(shù)據(jù)顯示，成像分析可以提供可操作的信息，以降低卵子過度成熟的風(fēng)險，識別出產(chǎn)卵質(zhì)量較低的雌魚。
作者貢獻(xiàn)聲明
格雷戈里·M·韋伯（Gregory M. Weber）：撰寫初稿、項目管理、方法學(xué)設(shè)計、實(shí)驗實(shí)施、數(shù)據(jù)分析、概念化。
盧克·R·伊瓦諾維奇（Luke R. Iwanowicz）：撰寫與編輯、方法學(xué)設(shè)計、實(shí)驗實(shí)施、數(shù)據(jù)分析。
馬克·A·霍斯圖特勒（Mark A. Hostuttler）：撰寫與編輯、監(jiān)督工作、方法學(xué)設(shè)計、實(shí)驗實(shí)施、數(shù)據(jù)分析。
吉爾·E·伯基特（Jill E. Birkett）：撰寫與編輯、實(shí)驗實(shí)施、數(shù)據(jù)分析。
蒂莫西·D·利茲（Timothy D. Leeds）：撰寫與編輯。
資金支持
本項工作得到了美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局CRIS項目（項目編號：8082-31000-013-00D）“提高虹鱒養(yǎng)殖效率的綜合研究方法”（“Integrated Research Approaches for Improving Efficiency in Rainbow Trout”）的支持。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務(wù)利益或個人關(guān)系可能影響本文所述的研究結(jié)果。
致謝
作者還要感謝NCCCWA的親魚和濕實(shí)驗室工作人員對動物的照料以及數(shù)據(jù)收集方面的協(xié)助。本文中使用的公司名稱僅出于提供信息和方便讀者的目的，并不代表美國農(nóng)業(yè)部或農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局對任何產(chǎn)品的官方認(rèn)可或推薦，也不排除其他可能適用的產(chǎn)品或服務(wù)。美國農(nóng)業(yè)部是一個提供平等機(jī)會的雇主。
