《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：PFKFB3-driven glycolysis in endothelial cells activates RhoA/ROCK1 to promote pulmonary vascular leakage in heatstroke
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熱應激與LPS共同作用下，內皮細胞屏障功能障礙是中暑引發(fā)急性肺損傷的關鍵因素，但其代謝機制尚不明確。本研究旨在探討PFKFB3介導的糖酵解是否通過激活RhoA/ROCK軸破壞內皮屏障完整性。研究結果顯示，在熱-LPS應激下，PFKFB3表達上調，激活糖酵解，進而激活RhoA/ROCK1/MLC2信號通路，導致細胞骨架重排、細胞連接破壞和血管通透性增加。靶向抑制PFKFB3-RhoA/ROCK1軸可恢復內皮屏障功能，這為中暑誘導的肺血管損傷提供了新的治療靶點。
隨著全球氣溫上升和極端熱浪事件日益頻繁，與中暑相關的死亡率正以驚人的速度增長。在重癥監(jiān)護下，勞力性中暑和經典型中暑的死亡率分別高達26.5%和63.2%。中暑不僅是一種危及生命的臨床綜合征，其特征不僅是直接的熱細胞毒性，還包括全身性紊亂，例如嚴重的內毒素血癥、循環(huán)衰竭、凝血病、暴發(fā)性全身炎癥反應和多器官功能障礙綜合征。其中，急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是中暑最嚴重的并發(fā)癥之一。肺微血管內皮細胞同時受到直接熱應激和LPS等細胞毒性介質的損傷，導致內皮通透性增加、病理性液體外滲和肺泡水腫，最終造成氣體交換障礙和呼吸衰竭。雖然已知內皮炎癥反應深受代謝重組的影響，尤其是糖酵解，但對于PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3）在中暑誘導內皮損傷中的作用，以及其是否通過激活RhoA/ROCK信號通路導致細胞骨架紊亂和屏障功能障礙，此前仍不清楚。這項研究旨在闡明這一機制，為開發(fā)新的治療策略提供依據。
為了探究這些問題，研究人員利用人肺微血管內皮細胞，構建了熱應激（43°C）聯(lián)合LPS刺激的體外中暑模型。通過使用PFKFB3抑制劑PFK15和針對PFKFB3、RhoA或ROCK的siRNA進行干預，結合代謝通量分析、轉錄組測序、Western blot、RhoA活性pull-down檢測、F-肌動蛋白免疫熒光和FITC-葡聚糖通透性測定等多種技術，系統(tǒng)研究了PFKFB3驅動的糖酵解如何激活RhoA/ROCK通路，進而導致內皮屏障功能障礙。
3. 研究結果
3.1. 熱應激和LPS共暴露觸發(fā)了HPMECs早期糖酵解活化，導致內皮屏障功能障礙
研究人員通過測量ECAR（細胞外酸化率）、OCR（耗氧率）、乳酸和ATP水平，發(fā)現(xiàn)熱-LPS應激在早期（熱應激2小時加LPS處理1小時）顯著增強了HPMECs的糖酵解通量，同時ATP產生也轉向糖酵解途徑。轉錄組分析證實了PFKFB3上調與促炎細胞因子通路之間的關聯(lián)。這種應激觸發(fā)了PFKFB3和RhoA/ROCK1/MLC2信號通路上調，導致了F-肌動蛋白應力纖維的形成、VE-鈣黏蛋白的分解和屏障高通透性。
3.2. 熱-LPS應激下HPMECs的糖酵解活化具有LPS濃度依賴性
研究顯示，熱應激協(xié)同LPS以濃度依賴性方式驅動HPMECs的代謝和結構重塑。使用亞毒性劑量的LPS（500和1000 ng/mL）進行代謝分析表明，1000 ng/mL處理組在ECAR、OCR、乳酸產生、ATP生成和糖酵解ATP水平方面均顯著高于500 ng/mL組。更高濃度的LPS也導致了更強的RhoA活性、ROCK1激活和MLC2磷酸化，并引發(fā)更明顯的肌動蛋白應力纖維形成、連接蛋白（VE-鈣黏蛋白和ZO-1）減少以及更高的內皮通透性。
3.3. 靶向糖酵解改善了熱應激和LPS共暴露介導的血管通透性增加
使用PFKFB3選擇性小分子抑制劑PFK15干預HPMECs。劑量反應實驗表明，10 μM PFK15有效抑制了ECAR和OCR的增加，同時抑制了乳酸和ATP的產生。機制研究進一步揭示，PFK15顯著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信號通路的激活，減少了肌動蛋白應力纖維的形成，維持了VE-鈣黏蛋白和ZO-1的連接，從而改善了內皮屏障功能。
3.4. PFKFB3調控熱-LPS應激下HPMECs糖酵解依賴性內皮高通透性
通過siRNA介導的PFKFB3敲低，證實PFKFB3是熱-LPS應激下HPMECs糖酵解的關鍵調節(jié)因子。基因干預有效抑制了熱-LPS誘導的ECAR、OCR、乳酸和ATP產生的增加。轉錄組分析顯示，靶向PFKFB3改善了HPMECs中整合的代謝-炎癥反應。機制分析進一步表明，PFKFB3沉默顯著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信號通路的激活，減少了肌動蛋白應力纖維的形成，保持了連接蛋白的完整性，并改善了內皮屏障功能。
3.5. 抑制RhoA改善了熱-LPS誘導的內皮屏障功能障礙
通過藥理學抑制和基因沉默方法探究RhoA的作用。使用RhoA特異性抑制劑Rhosin處理HPMECs，15 μM Rhosin顯著抑制了RhoA、ROCK1和MLC2的激活。Rhosin還顯著減少了應力纖維的形成，恢復了VE-鈣黏蛋白和ZO-1的完整性，并保留了內皮屏障功能。同樣，siRNA介導的RhoA敲低也顯著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信號通路的激活，并產生了與藥理學抑制一致的保護效果。
3.6. 抑制ROCK1減輕了熱-LPS應激誘導的HPMECs高通透性
在熱-LPS刺激前，用ROCK抑制劑Y-27632預處理HPMECs。劑量反應分析顯示，10 μM Y-27632有效減弱了MLC2磷酸化，同時免疫熒光定量表明，Y-27632處理顯著減少了F-肌動蛋白應力纖維的形成，防止了VE-鈣黏蛋白和ZO-1連接破壞，并保持了內皮屏障完整性。熱-LPS刺激后，ROCK1和ROCK2的蛋白水平均顯著增加。單獨的ROCK1沉默顯著減弱了熱-LPS誘導的ROCK1表達上調和其下游效應物MLC2的磷酸化，并產生了與藥理學抑制一致的保護效果。相比之下，ROCK2沉默并未減少MLC2磷酸化、應力纖維形成或連接蛋白破壞，也未改善屏障完整性，表明在此背景下ROCK1起核心作用。
4. 討論與結論
該研究揭示了熱應激和LPS聯(lián)合處理通過糖酵解依賴性機制破壞了HPMECs的內皮屏障。其潛在的分子機制可能涉及PFKFB3介導的糖酵解通量上調，進而激活RhoA/ROCK1信號軸，導致MLC磷酸化和應力纖維組裝。藥理學抑制PFKFB3有效緩解了這一病理過程并恢復了內皮屏障完整性。
本研究首次將代謝重組與中暑誘導的肺損傷聯(lián)系起來。研究發(fā)現(xiàn)，PFKFB3驅動的糖酵解是熱-LPS應激下內皮細胞激活和屏障破壞的關鍵代謝開關。糖酵解的增強激活了RhoA/ROCK1通路，進而通過磷酸化MLC和促進肌動蛋白-肌球蛋白收縮，導致細胞骨架重組、內皮細胞連接破壞和血管通透性急劇增加。這一“代謝-炎癥-骨架”軸（PFKFB3-RhoA/ROCK1-MLC）的闡明，為理解中暑相關肺血管滲漏提供了新的機制視角。靶向PFKFB3或下游的RhoA/ROCK1信號，可能成為緩解中暑誘導的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征的潛在治療策略。
這篇題為《PFKFB3-driven glycolysis in endothelial cells activates RhoA/ROCK1 to promote pulmonary vascular leakage in heatstroke》的研究論文，深入揭示了中暑導致肺損傷的新機制，并將代謝調控與細胞骨架動力學聯(lián)系起來，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。該研究發(fā)表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》期刊上。
