摘要

背景

缺血-再灌注（I/R）損傷是缺血性中風(fēng)（IS）預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，目前缺乏有效的神經(jīng)保護(hù)劑。補(bǔ)陽(yáng)還五湯（BYHWD）作為一種經(jīng)典的中藥療法，被廣泛認(rèn)為是治療IS的有效方法，其主要活性成分是黃芪-當(dāng)歸（HQDG）。初步研究表明，HQDG可以減輕腦部的I/R損傷，但其作用機(jī)制尚不明確。

材料與方法

建立了大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型。通過(guò)Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常腦組織、缺血核心區(qū)和半影區(qū)的NADPH氧化酶4（NOX4）和活性氧（ROS）水平。通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、HE染色、腦血流監(jiān)測(cè)、免疫熒光和Western blot等方法評(píng)估HQDG對(duì)神經(jīng)功能缺陷和神經(jīng)元凋亡（pyroptosis）的影響。利用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的NOX4過(guò)表達(dá)來(lái)驗(yàn)證這一機(jī)制，并結(jié)合TTC染色、透射電子顯微鏡和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果

在MCAO/R大鼠的缺血半影區(qū)，NOX4和ROS的表達(dá)水平顯著升高。HQDG不僅顯著改善了神經(jīng)功能，恢復(fù)了腦血流，并減輕了腦部病理?yè)p傷，還降低了與凋亡相關(guān)的指標(biāo)。XST也能改善模型大鼠的神經(jīng)功能，減輕腦部病理?yè)p傷，并抑制腦組織細(xì)胞的凋亡，但其效果不如HQDG明顯。為了進(jìn)一步闡明NOX4的機(jī)制，我們分別通過(guò)AAV介導(dǎo)的NOX4過(guò)表達(dá)和Apocynin進(jìn)行了靶向激活和抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，AAV組逆轉(zhuǎn)了HQDG對(duì)ROS生成和凋亡的抑制作用，反而加劇了神經(jīng)元和腦部的病理?yè)p傷。相反，Apocynin再現(xiàn)了HQDG的神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)抑制NOX4驅(qū)動(dòng)的ROS和凋亡來(lái)減輕I/R損傷。

結(jié)論

HQDG通過(guò)抑制凋亡來(lái)緩解腦部I/R損傷，這一作用是通過(guò)抑制NOX4介導(dǎo)的ROS積累實(shí)現(xiàn)的。

引言

隨著全球老齡化進(jìn)程的加速，神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為全球主要的疾病原因。中風(fēng)不僅是這些疾病中最常見(jiàn)的，而且預(yù)后最差（2024年數(shù)據(jù)）。此外，中風(fēng)的發(fā)病率和死亡率每年都在上升，研究人員估計(jì)到2050年，全球每年因中風(fēng)死亡的人數(shù)將接近1000萬(wàn)（Feigin和Owolabi，2023年）。中風(fēng)在臨床上分為缺血性和出血性兩種類型，其中缺血性中風(fēng)約占所有中風(fēng)的80%（Fu等人，2024年）。及時(shí)的臨床干預(yù)是治療缺血性中風(fēng)的關(guān)鍵，包括機(jī)械取栓術(shù)和靜脈溶栓治療，這些方法有助于恢復(fù)腦部血管的通暢（Nam和Kim，2023年）。然而，恢復(fù)血液灌注可能會(huì)加重腦組織損傷，這種現(xiàn)象稱為腦缺血-再灌注（I/R）損傷。盡管抗凝治療在臨床中得到廣泛應(yīng)用，但針對(duì)I/R損傷的藥物治療方案仍然不足（Kleindorfer等人，2021年）。 腦部I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣平衡失調(diào)和能量紊亂，這些因素相互影響、交織在一起，最終導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦組織損傷（Gong等人，2017年；Wang等人，2023年）。因此，開(kāi)發(fā)有效的治療策略以緩解腦部I/R損傷仍然是一個(gè)未解決的挑戰(zhàn)，近年來(lái)研究人員越來(lái)越重視炎癥過(guò)程在介導(dǎo)腦部I/R損傷中的作用（圖1）。 凋亡是一種與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞死亡類型，研究表明凋亡在腦部I/R損傷中起著關(guān)鍵作用（Li等人，2023年）。在腦部I/R損傷發(fā)生后，受損腦組織中的線粒體會(huì)迅速產(chǎn)生大量活性氧（ROS），ROS的積累被認(rèn)為是經(jīng)典凋亡的主要驅(qū)動(dòng)因素（Devant等人，2023年）。NADPH氧化酶4（NOX4）是內(nèi)源性ROS的主要來(lái)源之一（Fang等人，2021年），而NOX的主要亞型之一NOX4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)（Cooney等人，2013年）。研究表明，NOX4水平的升高會(huì)導(dǎo)致腦組織中ROS的產(chǎn)生增加（Park等人，2021年）。因此，我們認(rèn)為NOX4可能通過(guò)在中腦I/R損傷期間介導(dǎo)ROS積累來(lái)影響凋亡（圖2）。 在過(guò)去十年中，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注將中醫(yī)（TCM）應(yīng)用于腦缺血領(lǐng)域（Liu等人，2021年；Zhou等人，2024年）。作為著名的經(jīng)典中藥方劑，補(bǔ)陽(yáng)還五湯（BYHWD）對(duì)IS具有顯著的治療效果（Wang等人，2022年）。我們的團(tuán)隊(duì)一直致力于研究BYHWD治療中風(fēng)的基本機(jī)制（Yin等人，2023年；Zhao等人，2021年）。根據(jù)中醫(yī)理論，黃芪（Astragalus membranaceus）是BYHWD中的君藥，當(dāng)歸（Angelica sinensis）是臣藥。這兩種藥材的獨(dú)特配比和用量構(gòu)成了該方劑臨床效果的基礎(chǔ)。此外，黃芪和當(dāng)歸組成的HQDG相比BYHWD具有更簡(jiǎn)單的成分結(jié)構(gòu)，有利于研究它們?cè)谥委熂膊≈械木唧w作用機(jī)制。因此，HQDG在治療IS中的療效和機(jī)制值得進(jìn)一步研究（圖3）。 先前的研究表明，HQDG會(huì)影響IS過(guò)程中的凋亡，并且發(fā)現(xiàn)BYHWD可以通過(guò)下調(diào)NOX4來(lái)減少IS后的ROS生成。基于此，我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以探討HQDG是否通過(guò)調(diào)節(jié)NOX4介導(dǎo)的ROS積累來(lái)抑制凋亡，從而減輕腦部I/R損傷。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從遼寧長(zhǎng)盛生物技術(shù)有限公司購(gòu)買了7周齡（260～280克）的雄性無(wú)特定病原體（SPF）Sprague-Dawley（SD）大鼠[SCXK(Liao)2020–0001]。所有動(dòng)物在建立模型前都經(jīng)過(guò)了一周的適應(yīng)期。本實(shí)驗(yàn)獲得了河北中醫(yī)薬大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：DWLL202309004）。

實(shí)驗(yàn)藥物

HQDG由兩種藥材組成：Astragalus membranaceus和Angelica sinensis

第一部分：MCAO/R大鼠正常腦組織、缺血核心區(qū)和缺血半影區(qū)中NOX4和ROS水平的差異

為了研究腦部I/R損傷對(duì)腦組織中NOX4和ROS水平的影響，我們使用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)觀察了MCAO/R大鼠不同腦組織區(qū)域的NOX4和ROS初始差異。Western blot結(jié)果顯示，在腦缺血和再灌注3天后，缺血半影區(qū)的腦組織中NOX4的表達(dá)量顯著高于正常腦皮層和缺血核心區(qū)（圖4A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明...

討論

由于發(fā)病率、致殘率和死亡率較高，IS被認(rèn)為是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題（2024年數(shù)據(jù)）。由于該疾病的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，目前仍缺乏有效的神經(jīng)保護(hù)劑。炎癥細(xì)胞壞死（即凋亡）表現(xiàn)為細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)張直至膜破裂，釋放大量促炎因子，從而引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)（...

結(jié)論

總體而言，我們觀察到HQDG在體內(nèi)能夠減輕腦部I/R損傷。NOX4介導(dǎo)的ROS積累導(dǎo)致的廣泛神經(jīng)元凋亡可能是腦部I/R損傷的重要病理機(jī)制。HQDG通過(guò)抑制NOX4介導(dǎo)的ROS積累來(lái)保護(hù)神經(jīng)元。這些發(fā)現(xiàn)為基于傳統(tǒng)中藥的IS療法及其相關(guān)治療機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)...

作者貢獻(xiàn)聲明

柴成軒：撰寫(xiě)原始稿件、數(shù)據(jù)可視化、方法設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理。 劉璐瑤：撰寫(xiě)原始稿件、數(shù)據(jù)可視化、方法設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理。 王瑞坤：撰寫(xiě)原始稿件、數(shù)據(jù)可視化、方法設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理。 袁麗榮：監(jiān)督研究、概念構(gòu)思。 侯賢明：監(jiān)督研究、概念構(gòu)思。 趙偉：監(jiān)督研究、資金籌集、概念構(gòu)思。 杜淑珍：監(jiān)督研究、資金籌集、概念構(gòu)思。 盧文靜：軟件應(yīng)用、格式處理。

資助

本研究的資金來(lái)自：國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)82104963）、河北省中醫(yī)藥科學(xué)研究計(jì)劃（2024336）、河北省高等教育科學(xué)研究項(xiàng)目（QN2025117）、河北省高等教育機(jī)構(gòu)科學(xué)研究項(xiàng)目（QN2022069）以及河北省衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究計(jì)劃（20211106）。

利益沖突聲明

作者聲明沒(méi)有已知的利益沖突或個(gè)人關(guān)系可能影響本文的研究結(jié)果。