《Cancer Letters》：YTHDF1-mediated RNA m1A methylation promotes malignant progression of hepatocellular carcinoma via regulating LRP5/Wnt-β-catenin axis
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本研究關注肝細胞癌（HCC）進展的分子機制。為了解決YTHDF1蛋白在HCC中的作用及其通過RNA m1A修飾調控的具體通路尚不明確的問題，研究人員開展了YTHDF1與LRP5/Wnt/β-catenin信號軸關系的主題研究。結果表明，YTHDF1在HCC中高表達且與不良預后相關，其通過識別并穩定LRP5 mRNA上的m1A修飾，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進HCC細胞的增殖與侵襲。該發現為HCC的預后評估和靶向治療提供了新的潛在靶點。
肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范圍內最常見的原發性肝臟惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率長期居高不下。盡管診斷和治療手段在不斷進步，但晚期HCC患者的預后仍然很差，5年生存率不足，且術后復發和化療耐藥問題突出。因此，深入探究HCC發生發展的分子機制，尋找有效的治療靶點和預后標志物，是改善HCC臨床管理的關鍵。近年來，RNA修飾，特別是N6-甲基腺苷（m6A），在腫瘤中的調控作用受到廣泛關注。然而，另一種重要的RNA修飾——N1-甲基腺苷（m1A）——在HCC中的作用尚不明確。YTH結構域家族蛋白1（YTH domain family protein 1, YTHDF1）是m6A和m1A修飾的關鍵“閱讀器”蛋白，已在多種癌癥中被證實與腫瘤惡性表現相關，但其在HCC中通過m1A修飾介導的具體分子機制仍是一團迷霧。同時，Wnt/β-catenin信號通路在HCC中頻繁異常激活，是驅動腫瘤進展的核心通路之一。低密度脂蛋白受體相關蛋白5（Low-density lipoprotein receptor-related protein 5, LRP5）作為該通路的關鍵輔助受體，其表達調控對通路活性至關重要。那么，YTHDF1是否通過調控m1A修飾來影響Wnt/β-catenin通路，進而促進HCC進展呢？這項發表在《Cancer Letters》上的研究，正是為了解答這個核心問題而展開的探索。
本研究綜合運用了生物信息學分析、組織微陣列、體外功能實驗和體內異種移植模型等多種技術方法。首先，利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫和購買的包含90對HCC與正常肝組織的組織微陣列（TMA），分析了YTHDF1的表達及其與臨床預后的關系。其次，在HCC細胞系（Huh7和Hep3B）中通過shRNA敲低或過表達YTHDF1，采用集落形成、EdU增殖、Transwell侵襲等實驗評估其對細胞惡性表型的影響。通過m1A甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）、RNA測序（RNA-seq）、RNA免疫沉淀-qPCR（RIP-qPCR）、MeRIP-qPCR等技術，描繪了YTHDF1調控的m1A修飾圖譜，并鑒定出其下游靶基因。利用放線菌素D實驗和雙熒光素酶報告基因實驗驗證了YTHDF1對靶基因mRNA穩定性的影響。最后，通過裸鼠皮下移植瘤模型，在體內驗證了YTHDF1和LRP5對腫瘤生長的調控作用。
研究結果部分揭示了以下幾個關鍵發現：
3.1. YTHDF1表達上調與HCC進展和不良預后相關
生物信息學分析顯示，YTHDF1在包括HCC在內的多種惡性腫瘤中表達顯著上調。在HCC中，YTHDF1的高表達與更晚的T分期、TNM分期以及更低的分化程度相關，并且預示著更短的總生存期。組織微陣列和Western blot分析進一步在臨床樣本中證實，YTHDF1在HCC腫瘤組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織。這些結果表明，YTHDF1的上調與HCC的惡性進展和不良預后密切相關，可能作為一個有價值的預后生物標志物。
3.2. YTHDF1敲低抑制HCC細胞的增殖和侵襲
在Huh7和Hep3B細胞中敲低YTHDF1后，細胞的集落形成能力、EdU標記的增殖細胞比例以及Transwell侵襲能力均顯著下降。相反，過表達YTHDF1則增強了這些惡性表型。體內實驗也表明，過表達YTHDF1的細胞在裸鼠中形成的移植瘤體積和重量更大。這些功能實驗證實YTHDF1是驅動HCC進展的關鍵因子。
3.3. YTHDF1調控HCC中的m1A修飾圖譜和Wnt信號通路
為了探究機制，研究人員進行了MeRIP-seq分析。結果顯示，敲低YTHDF1后，細胞內的m1A修飾圖譜發生了顯著改變，特定轉錄本的修飾水平發生變化，且m1A在mRNA編碼區（CDS）的分布比例增加。基因本體（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）均提示，差異基因顯著富集于Wnt信號通路等與細胞增殖相關的生物學過程。Western blot實驗證實，敲低YTHDF1會降低Wnt通路關鍵蛋白β-catenin、Cyclin D1和c-myc的水平，而過表達YTHDF1則提升這些蛋白水平。這表明YTHDF1可能通過調控Wnt/β-catenin通路活性來發揮作用。
3.4. YTHDF1通過m1A介導的調控作用于LRP5來調節Wnt信號
通過整合MeRIP-seq（m1A下調靶標）、RNA-seq（轉錄組）和Wnt通路基因集，研究人員篩選出7個重疊基因，其中LRP5的表達在YTHDF1敲低后顯著下降。相關性分析顯示YTHDF1與LRP5的表達呈正相關。RIP-qPCR實驗證實YTHDF1蛋白能夠直接結合LRP5 mRNA。MeRIP-qPCR和IGV基因組瀏覽器可視化均表明，敲低YTHDF1后，LRP5轉錄本上的m1A修飾水平降低。放線菌素D實驗證明YTHDF1敲低加速了LRP5 mRNA的降解，表明YTHDF1通過增強LRP5 mRNA的穩定性來上調其表達。雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證了一個特定的m1A修飾位點對LRP5 mRNA功能的影響。這些結果共同表明，YTHDF1通過識別LRP5 mRNA上的m1A修飾并增強其穩定性，從而正調控LRP5的表達。
3.5. LRP5敲低抑制HCC細胞的增殖和侵襲
TCGA數據分析顯示LRP5在HCC組織中高表達，且具有診斷價值。功能上，敲低LRP5能抑制HCC細胞的集落形成和侵襲能力，而過表達LRP5則產生相反的促進作用，并在體內促進腫瘤生長。這證實了LRP5本身在HCC中具有促癌作用。
3.6. YTHDF1通過LRP5介導的Wnt/β-catenin信號通路調控HCC進展
挽救實驗是驗證上下游關系的關鍵。研究發現，在敲低YTHDF1的細胞中過表達LRP5，可以部分逆轉由YTHDF1敲低導致的Wnt通路關鍵蛋白（c-myc, Cyclin D1, β-catenin）表達下降、細胞增殖和侵襲能力減弱，以及β-catenin核轉位減少等表型。體內實驗也得到一致結果：同時敲低YTHDF1和過表達LRP5的移植瘤，其大小和重量介于單獨處理組之間，且腫瘤組織中增殖標志物Ki-67和通路蛋白的表達也呈現相應的部分回補效應。這些數據強有力地證明，YTHDF1是通過上調LRP5來激活Wnt/β-catenin信號通路，進而驅動HCC的惡性進展。
該研究的結論與討論部分對上述發現進行了總結和延伸。本研究首次系統地揭示了YTHDF1通過m1A修飾在HCC中的促癌作用及其具體機制。研究表明，YTHDF1在HCC中高表達且與不良預后相關。其作為m1A“閱讀器”，能夠直接結合并穩定LRP5 mRNA，從而上調LRP5蛋白表達。LRP5作為Wnt/β-catenin通路的關鍵輔助受體，其表達增加激活了下游通路，最終促進了HCC細胞的增殖、侵襲和體內腫瘤生長。這一“YTHDF1-m1A-LRP5-Wnt/β-catenin”軸為理解HCC的表觀遺傳調控提供了新的視角。
研究的重要意義在于：首先，它將RNA表觀遺傳學修飾（m1A）與經典的致癌信號通路（Wnt/β-catenin）聯系起來，深化了對HCC發病機制的理解。其次，它鑒定出YTHDF1和LRP5作為HCC潛在的預后生物標志物和新的治療靶點。針對YTHDF1或其介導的m1A修飾環節進行干預，可能為開發新的HCC治療策略提供思路。當然，作者也指出了研究的局限性，例如未全面考察其他m1A調節因子（如甲基轉移酶和去甲基化酶）的作用，以及體內實驗僅使用了雄性小鼠等。未來研究需要在更廣泛的模型和臨床樣本中驗證YTHDF1靶向治療的潛力。總之，這項工作闡明了YTHDF1介導的m1A修飾通過LRP5/Wnt-β-catenin軸促進HCC惡性進展的新機制，為HCC的精準治療開辟了新的可能性。
