革蘭氏陽(yáng)性菌與絲狀真菌機(jī)械破壁效果對(duì)比：pH調(diào)控結(jié)合微流控與超聲處理對(duì)蛋白質(zhì)提取效率的影響研究
《Future Foods》：Comparative study of mechanical cell disruption methods on bacteria and fungi
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為提升微生物單細(xì)胞蛋白(SCP)在食品應(yīng)用中的溶解性與功能特性，本研究通過pH調(diào)控預(yù)處理結(jié)合微流控化、超聲及聯(lián)合處理，系統(tǒng)比較了革蘭氏陽(yáng)性菌（酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum）與絲狀真菌（微小根毛霉Rhizomucor pusillus）的細(xì)胞破碎效果。研究揭示了pH對(duì)細(xì)胞壁通透性及破碎效率的顯著影響，明確了針對(duì)不同微生物（細(xì)菌與真菌）的有效破壁策略差異（如細(xì)菌在pH 2條件下超聲處理效率最高，真菌則在pH 10下采用聯(lián)合處理效果最佳），并對(duì)可溶提取物的組分與能量效率進(jìn)行了評(píng)估。研究成果為針對(duì)不同微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)高效、低能耗的食品級(jí)蛋白質(zhì)提取技術(shù)提供了重要理論依據(jù)。
面對(duì)全球?qū)沙掷m(xù)蛋白質(zhì)日益增長(zhǎng)的需求，微生物單細(xì)胞蛋白(Single-cell protein, SCP)因其快速繁殖和較小的土地使用壓力而成為替代傳統(tǒng)動(dòng)物蛋白的潛力股。然而，這些寶藏被堅(jiān)硬的細(xì)胞壁“封鎖”，限制了其蛋白質(zhì)的溶出，進(jìn)而影響了在食品中作為乳化劑或發(fā)泡劑等功能的發(fā)揮。如何高效、經(jīng)濟(jì)地“破壁”取“寶”，成為了微生物蛋白應(yīng)用的一大技術(shù)瓶頸。
為了解決這一關(guān)鍵問題，由Yi Ling Chin、María Julia Romani Moron、Remko M. Boom和Julia K. Keppler組成的研究團(tuán)隊(duì)，對(duì)兩種前景廣闊的SCP來源——革蘭氏陽(yáng)性菌（酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum）和絲狀真菌（微小根毛霉Rhizomucor pusillus）——的細(xì)胞破碎方法進(jìn)行了系統(tǒng)性比較研究，成果發(fā)表在《Future Foods》期刊上。
研究者們運(yùn)用了幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)來探究這一問題。首先，他們采用了pH調(diào)控預(yù)處理，將細(xì)胞懸浮液調(diào)整至不同pH值（2、4、6、8、10）以改變細(xì)胞壁通透性。隨后，應(yīng)用了三種機(jī)械破碎方法：微流控化(Microfluidisation)，利用高壓和微通道產(chǎn)生強(qiáng)剪切力；超聲波處理(Ultrasonication)，通過空化效應(yīng)產(chǎn)生局部沖擊波；以及兩者的組合處理。評(píng)估體系則包括可溶性蛋白回收率測(cè)定、粒度分析、透射電鏡(TEM)和共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)成像、傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 分析可溶組分的相對(duì)組成、動(dòng)態(tài)光散射(DLS) 測(cè)定流體動(dòng)力學(xué)尺寸，并計(jì)算了各處理方法的能量效率（單位回收蛋白的能耗）。
3.1. pH對(duì)可溶性蛋白回收率的影響
研究發(fā)現(xiàn)，在不進(jìn)行機(jī)械處理的情況下，極端pH值（pH 2和pH 10）能顯著提高兩種微生物的可溶性蛋白回收率，呈現(xiàn)典型的“U”型曲線趨勢(shì)，表明pH通過改變細(xì)胞壁聚合物的靜電相互作用等，影響了細(xì)胞的通透性。
3.2. 細(xì)胞破碎方法的比較
3.2.1. 可溶性蛋白回收率
細(xì)菌在pH 2條件下經(jīng)超聲波處理獲得了最高回收率（49.6%），接近其理論最大回收率（54.3%）。而真菌則在pH 10條件下，經(jīng)微流控化與超聲的聯(lián)合處理獲得了最高回收率（29.1%），也接近其理論最大值（37.3%）。這凸顯了最佳pH條件與破碎方法的選擇因微生物種類而異。
3.2.2. 粒度
粒度分析顯示，pH和破碎方法顯著改變了顆粒尺寸分布。細(xì)菌懸浮液在超聲處理后出現(xiàn)了30-90 μm的較大顆粒峰，表明可能發(fā)生了聚集。而真菌懸浮液經(jīng)微流控化處理后，粒度明顯減小，聯(lián)合處理的粒度分布與單獨(dú)微流控化處理相似。
3.2.3. 顯微鏡觀察
TEM和CLSM圖像直觀地展示了破碎效果。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)碎裂。超聲處理的細(xì)菌樣本出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象。真菌的菌絲被破碎成更小的片段，但許多細(xì)胞仍被細(xì)胞壁包裹，聯(lián)合處理使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)更易釋放。
3.3. 可溶組分的表征
3.3.1. FTIR測(cè)定的相對(duì)組成
細(xì)菌可溶組分的蛋白質(zhì)-碳水化合物比值普遍大于1，表明其中蛋白質(zhì)更豐富，尤其在pH 2下經(jīng)機(jī)械破碎后比值顯著升高。而真菌可溶組分的該比值小于1，且在高pH下經(jīng)破碎后比值下降，說明破碎過程釋放了大量的細(xì)胞壁碳水化合物。
3.3.2. 流體動(dòng)力學(xué)尺寸
細(xì)菌可溶組分的流體動(dòng)力學(xué)尺寸在pH 2下經(jīng)破碎后減小。真菌可溶組分在pH 10下未處理時(shí)尺寸最大，破碎后尺寸顯著減小，可能與堿性條件下可溶的α-1,3-葡聚糖在破碎過程中發(fā)生解聚有關(guān)。
3.4. 破碎方法的能量效率
計(jì)算表明，對(duì)于兩種微生物，超聲波處理都是能量效率最高的方法。然而，由于真菌細(xì)胞壁更厚、更復(fù)雜，且初始生物質(zhì)濃度更稀，破碎真菌所需的單位能量遠(yuǎn)高于細(xì)菌（例如，細(xì)菌超聲處理為10.1 kJ/g蛋白，而真菌為358.0 kJ/g蛋白）。微流控化因其高操作壓力，能耗顯著更高。
研究結(jié)論與討論部分深刻闡述了微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與成分對(duì)蛋白質(zhì)可提取性的影響。對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸構(gòu)成，在極端pH下靜電相互作用被破壞，結(jié)構(gòu)變得疏松。超聲波處理在pH 2條件下不僅能有效破碎細(xì)胞，其空化效應(yīng)還能破壞蛋白質(zhì)聚集體的非共價(jià)鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解和重構(gòu)，形成具有潛在食品應(yīng)用價(jià)值（如增稠、凝膠）的蠕蟲狀聚集體。對(duì)于絲狀真菌，其細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、葡聚糖和糖蛋白構(gòu)成的復(fù)合物更為堅(jiān)固，需要更強(qiáng)的機(jī)械力。微流控化提供的整體剪切力能有效破碎菌絲網(wǎng)絡(luò)，而后續(xù)的超聲波處理則能進(jìn)一步作用于碎片，實(shí)現(xiàn)更徹底的細(xì)胞裂解，因此在pH 10下的聯(lián)合處理效果最佳。但聯(lián)合處理因微流控化步驟的高能耗而并非最節(jié)能的選擇。
該研究的重要意義在于，它清晰地揭示了對(duì)不同微生物（原核細(xì)菌與真核真菌）進(jìn)行蛋白質(zhì)提取時(shí)，不存在“一刀切”的最佳方案。pH預(yù)處理是增強(qiáng)細(xì)胞通透性的關(guān)鍵步驟，但其最佳條件因細(xì)胞壁化學(xué)成分而異。機(jī)械破碎方法的選擇需考慮細(xì)胞壁的厚度和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性：薄而相對(duì)均一的細(xì)菌壁易被局部空化力擊破，而厚且分層的真菌壁則需要分布更廣的剪切力。研究強(qiáng)調(diào)了在追求高蛋白回收率的同時(shí)，必須權(quán)衡能量效率和最終提取物特性（如蛋白質(zhì)與碳水化合物的比例）。這些發(fā)現(xiàn)為未來針對(duì)特定微生物來源，設(shè)計(jì)更具靶向性、更高效且更可持續(xù)的食品級(jí)蛋白質(zhì)提取工藝提供了寶貴的科學(xué)依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。
