《International Journal of Applied Earth Observation and Geoinformation》：Effect of intranasal treatment with NAMPT-EVs on acetylated tau and cognitive function in mice with repeated controlled cortical injury
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NAMPT-EVs通過激活SIRT1減少rCCI小鼠腦內(nèi)乙�；痶au蛋白，抑制神經(jīng)炎癥，改善腦脊液循環(huán)，從而保護(hù)神經(jīng)元和認(rèn)知功能。
陳偉能|吳子聰|林立山|黃森|姜秋紅|黃恒|謝英春|黃龍新|李格|傅青玲|裴忠|姚曉麗
神經(jīng)內(nèi)科，廣東省重大神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室附屬第一醫(yī)院；中山大學(xué)神經(jīng)病學(xué)國(guó)家重點(diǎn)臨床科室及重點(diǎn)學(xué)科，中國(guó)廣東省廣州市510080
摘要
背景
反復(fù)的創(chuàng)傷性腦損傷（rTBI）由于其長(zhǎng)期對(duì)認(rèn)知和行為的影響而受到越來越多的關(guān)注。研究表明，乙酰化的tau蛋白（ac-tau）是連接rTBI和阿爾茨海默病（AD）的常見病理機(jī)制，可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。因此，在本研究中，我們?cè)u(píng)估了富含煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡（NAMPT-EVs）在改善反復(fù)控制性皮質(zhì)損傷（rCCI）后的認(rèn)知和行為障礙方面的治療潛力。
方法
在rCCI后1個(gè)月，通過鼻內(nèi)給予NAMPT-EVs，評(píng)估了Morris水迷宮和新型物體識(shí)別測(cè)試的結(jié)果。治療后1個(gè)月，檢測(cè)了Sirtuin 1（SIRT1）、ac-tau的表達(dá)、神經(jīng)元損失、神經(jīng)炎癥、AQP4極性以及腦膜淋巴系統(tǒng)的形態(tài)和功能。
結(jié)果
鼻內(nèi)給予NAMPT-EVs顯著增加了rCCI小鼠中SIRT1的表達(dá)，從而去乙�；痶au蛋白。此外，NAMPT-EVs抑制了神經(jīng)炎癥，并保持了水通道蛋白-4的極性，促進(jìn)了淋巴系統(tǒng)的功能，有利于清除腦實(shí)質(zhì)中的ac-tau。值得注意的是，ac-tau的減少防止了軸突初始段的降解和tau蛋白的錯(cuò)誤定位，從而產(chǎn)生了神經(jīng)保護(hù)作用。
結(jié)論
NAMPT-EVs通過多種機(jī)制減少了神經(jīng)元損失并改善了rCCI小鼠的認(rèn)知功能。因此，NAMPT-EVs在預(yù)防rTBI后的認(rèn)知缺陷方面具有潛力。
引言
創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的發(fā)病率每年約為5000萬例，造成的成本約為4000億美元[1]。最近，反復(fù)TBI（rTBI）的長(zhǎng)期慢性影響受到了越來越多的關(guān)注，尤其是在軍事人員和專業(yè)運(yùn)動(dòng)員中。臨床上，rTBI與長(zhǎng)期記憶缺陷相關(guān)，并顯著增加了患阿爾茨海默�。ˋD）的風(fēng)險(xiǎn)[2]，[3]。越來越多的證據(jù)表明，這兩種疾病之間存在共同的病理機(jī)制，即乙�；痆4]，[5]。此外，AD和慢性創(chuàng)傷性腦病患者中ac-tau蛋白的水平升高[6]，[7]。tau蛋白的乙酰化可以使其從微管上脫離并促進(jìn)其聚集，從而導(dǎo)致早期tau病理相關(guān)的記憶喪失[8]，[9]。因此，針對(duì)tau蛋白乙�；闹委煼椒ǹ赡苁莚TBI和AD早期干預(yù)的有希望的療法。
Sirtuin 1（SIRT1）是第三類去乙�；讣易宓年P(guān)鍵成員，在能量代謝、炎癥和氧化應(yīng)激中起著重要作用[10]，[11]，它是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙�；竅12]。當(dāng)SIRT1去乙酰化蛋白質(zhì)底物時(shí)，NAD+分解為煙酰胺和腺苷二磷酸核糖[13]。然后，煙酰胺通過限速酶煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）[14]，[15]重新轉(zhuǎn)化為NAD+，這是哺乳動(dòng)物中NAD+生物合成與SIRT1活性之間的關(guān)鍵鏈接。因此，補(bǔ)充NAMPT可能對(duì)去乙酰化的tau蛋白有效。
清除系統(tǒng)，包括淋巴系統(tǒng)和腦膜淋巴系統(tǒng)，對(duì)于清除神經(jīng)毒性腦蛋白至關(guān)重要[16]。臨床上，血漿中的β-淀粉樣蛋白（Aβ）和tau蛋白濃度與淋巴系統(tǒng)和腦膜淋巴系統(tǒng)的功能有關(guān)[17]。值得注意的是，rTBI會(huì)損害這兩個(gè)系統(tǒng)[18]，[19]，這可能會(huì)干擾ac-tau的清除。
細(xì)胞外囊泡（EVs）是直徑40-100納米的囊泡，富含各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、信使RNA和多種生長(zhǎng)因子[20]。由于它們獨(dú)特的磷脂雙層結(jié)構(gòu)，它們可以在體液中穩(wěn)定存在并自由穿過血腦屏障。因此，EVs被設(shè)計(jì)為遞送分子以治療AD和其他神經(jīng)退行性疾病[21]，[22]，[23]，并選擇性地針對(duì)相關(guān)的腦部病理[24]。這種無細(xì)胞的方法是從早期專注于通過調(diào)節(jié)局部環(huán)境來修復(fù)受損大腦的干細(xì)胞移植策略演變而來的[25]。研究進(jìn)一步發(fā)展了這一范式，探索了組合策略以提高治療效果，例如將干細(xì)胞移植與二十二碳六烯酸（DHA）等支持性分子結(jié)合使用[26]�；谶@一功能增強(qiáng)概念，我們的研究引入了一種下一代方法，通過富集NAMPT來改造外泌體（NAMPT-EVs）。這種策略將“增強(qiáng)”功能內(nèi)置于囊泡本身，創(chuàng)造出一種強(qiáng)大且精準(zhǔn)定位的生物制劑，超越了天然MSC-EVs的固有修復(fù)能力。
鼻內(nèi)給藥是一種高效、非侵入性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）藥物遞送途徑[27]，允許重復(fù)給藥，并已廣泛用于治療CNS疾病的研究[28]，[29]，[30]。在本研究中，我們旨在評(píng)估作為NAMPT遞送系統(tǒng)的鼻內(nèi)給藥EVs是否可以保護(hù)rTBI小鼠免受長(zhǎng)期記憶缺陷的影響。
部分摘錄
NAMPT誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（iPSC-MSCs）的制備
本研究中使用的人類iPSC-MSCs按照先前的描述制備[31]，并在傳代10-15代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過將HEK393T細(xì)胞與NAMPT（基因ID：10135）質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，并使用聚乙炔亞胺（PEI）在Opti-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行包裝，生成慢病毒顆粒。后續(xù)培養(yǎng)使用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Cytiva，美國(guó)洛根）和10%胎牛血清（FBS；Gibco，美國(guó)格蘭德島）。6小時(shí)后
NAMPT-EVs的制備和表征
圖1A展示了NAMPT-iPSC-MSC和NAMPT-EVs的制備過程。我們成功建立了NAMPT-iPSC-MSCs；幾乎100%的NAMPT-MSCs通過mCherry陽(yáng)性染色被識(shí)別（圖1B）。通過陰離子交換色譜法從MSC和NAMPT-iPSC-MSC上清液中獲得了MSC-EVs和NAMPT富集的EVs。MSC-EVs和NAMPT-EVs的峰值大小分別為87納米和98納米（典型范圍：50-200納米）（圖1C），并且被表征為雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)
討論
NAMPT-EVs通過多種機(jī)制在rCCI小鼠模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，特別是通過SIRT1激活來去乙酰化tau蛋白。盡管磷酸化的tau蛋白在人類TBI中起重要作用，但在TBI后的急性期，tau蛋白的乙�；鼮轱@著，腦脊液中的ac-tau水平顯著升高[39]。相比之下，我們?cè)趓CCI小鼠模型中觀察到持續(xù)的tau蛋白乙酰化。通過減少ac-tau，鼻內(nèi)給藥后1個(gè)月的認(rèn)知功能得到了改善
結(jié)論
我們的研究發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)給予NAMPT-EVs通過多種機(jī)制減少了ac-tau，包括增加SIRT1以去乙酰化tau蛋白，以及保護(hù)淋巴系統(tǒng)和腦膜淋巴系統(tǒng)以清除ac-tau。這些能力使其成為預(yù)防rTBI患者長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙的有希望的療法。
作者貢獻(xiàn)
W.C.、Z.P.和X.Y.：研究概念和設(shè)計(jì)；W.C.、Z.W.、Q.F.和Z.P.：方法開發(fā)和論文撰寫、審閱和修訂；L.L.、S.H.、H.H.、Q.J.、Y.X.和L.H.：數(shù)據(jù)獲取、分析和解釋以及統(tǒng)計(jì)分析；G.L.：技術(shù)和材料支持。所有作者均閱讀并批準(zhǔn)了最終論文。
作者貢獻(xiàn)聲明
陳偉能：撰寫——初稿，項(xiàng)目管理，方法學(xué)，概念化。吳子聰：撰寫——初稿，資源獲取，項(xiàng)目管理，方法學(xué)。林立山：方法學(xué)，形式分析。黃森：項(xiàng)目管理，方法學(xué)。姜秋紅：項(xiàng)目管理。黃恒：項(xiàng)目管理。謝英春：資源獲取。黃龍新：方法學(xué)。李格：監(jiān)督，項(xiàng)目管理。傅青玲：資源獲取，方法學(xué)，資金支持
倫理聲明
該研究獲得了中山大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合ARRIVE指南 Checklist的要求。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競(jìng)爭(zhēng)性財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系可能會(huì)影響本文所述的工作。
致謝
部分圖表由田書軍繪制。我們感謝所有參與這項(xiàng)研究的同事和朋友。本研究得到了中國(guó)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFA1104900, 2022YFA1104904）、國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：82401672, 82271266, 82071255, 82271448, 82271144, 81970863）、廣東省重大神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助
