藻膽蛋白（PBPs）是一種高價值的熒光色素，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域，但從難處理的大型藻類生物質(zhì)中高效提取這些色素仍然是一個挑戰(zhàn)。本研究建立了一種從綠色大型藻類Chaetomorpha aerea中提取和純化PBPs的優(yōu)化方案。這種藻類的細胞壁結(jié)構(gòu)較為頑固，導(dǎo)致其生物質(zhì)難以有效利用。為克服傳質(zhì)限制，本研究采用了雙重酶輔助提取（EAE）和微波輔助提取（MAE）的方法。通過響應(yīng)面方法（RSM）優(yōu)化提取條件，最終確定最佳參數(shù)為：使用2.08%的纖維素酶濃度孵育90分鐘，隨后進行270.06瓦的微波照射130.17秒。在此條件下，藻藍蛋白（APC）的提取量為0.269毫克/毫升，C-藻藍蛋白（C-PC）為0.404毫克/毫升，R-藻紅蛋白（R-PE）為0.346毫克/毫升。粗提取物通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾和離子交換色譜法進行純化，純度分別達到2.23±0.07（APC）、4.21±0.25（C-PC）和3.23±0.11（R-PE）。LC–MS/MS分析確認了純化色素的分子身份，肽鑒定置信度≥98.5%。生物活性測試表明，純化的PBPs具有顯著的抗氧化潛力，并對MCF-7乳腺癌細胞表現(xiàn)出劑量依賴性的細胞毒性。這些結(jié)果表明，EAE-MAE聯(lián)合策略能有效提高色素提取效率，使Chaetomorpha aerea成為功能性食品、生物技術(shù)和制藥應(yīng)用的可持續(xù)原料。

引言

藻膽蛋白（PBPs）是一類高熒光性的水溶性色素，在藍細菌和紅藻、藍綠藻的光合作用系統(tǒng)中作為輔助光捕獲結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。這些色素具有鮮艷的自然顏色和強自熒光特性，因此在食品著色、化妝品、診斷和治療等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價值[1][2]。根據(jù)其吸收和發(fā)射特性，PBPs主要分為藻藍蛋白（APC）、藻藍蛋白（PC）和藻紅蛋白（PE）。由于具有高量子產(chǎn)率、較大的斯托克斯位移以及易于與抗體或其他生物分子標記物結(jié)合，PBPs被廣泛用作流式細胞術(shù)、熒光顯微鏡和免疫分析中的熒光探針[3]。其強烈的穩(wěn)定熒光特性還促進了串聯(lián)熒光團的開發(fā)，從而實現(xiàn)多重檢測和提高分析靈敏度。然而，分析級和生化級的PBPs純度指數(shù)（PI）需大于3.0，這通常需要多步純化過程，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。因此，開發(fā)高效、低成本且環(huán)保的提取和純化方法成為重要研究課題。

綠色大型藻類Chaetomorpha aerea屬于枝角藻科，易于培養(yǎng)，生長迅速且生物量產(chǎn)出高。Chaetomorpha屬植物含有豐富的生物活性化合物，如抗氧化劑、抗菌劑、抗真菌劑和降壓劑[4][5][6][7]。在越南，C. aerea全年分布于沿海和河口生態(tài)系統(tǒng)，尤其是在湄公河三角洲地區(qū)。先前的研究已證實其抗氧化和抗菌潛力[8]。然而，目前僅有一小部分這種豐富的生物質(zhì)被利用（例如作為動物飼料或肥料），大部分仍未得到開發(fā)。這種資源未得到充分利用不僅可能造成沿海地區(qū)的環(huán)境污染，還浪費了可轉(zhuǎn)化為高價值生物產(chǎn)品的寶貴自然資源。

然而，從細胞內(nèi)有效提取這些色素面臨重大生物物理挑戰(zhàn)。Chaetomorpha的細胞壁由難以降解的纖維素和硫酸化半乳聚糖構(gòu)成，成為限制色素釋放的主要障礙[8]。傳統(tǒng)提取方法往往需要較長時間或苛刻條件，導(dǎo)致熱敏感的PBPs降解[1][2]。為此，本研究提出了一種結(jié)合生物化學(xué)和物理方法的聯(lián)合提取策略：酶輔助提取（EAE）可水解多糖網(wǎng)絡(luò)增加細胞孔隙度，而微波輔助提取（MAE）可快速升溫并產(chǎn)生內(nèi)部壓力導(dǎo)致細胞破裂[9]。預(yù)計這種聯(lián)合方法能在溫和條件下最大化PBPs的提取效率并保持其生物活性。盡管EAE和MAE已用于藻類色素提取，但現(xiàn)有研究大多集中在單一色素類型（如C-藻藍蛋白（C-PC）或R-藻紅蛋白（R-PE）的提取，或使用商業(yè)化的生物質(zhì)來源（如螺旋藻Spirulina）或紫菜Porphyra）。關(guān)于從未充分利用的綠色大型藻類中同時提取和純化所有三種PBPs（APC、C-PC和R-PE）的綜合性數(shù)據(jù)仍十分匱乏。因此，本研究針對Chaetomorpha aerea的頑固生物質(zhì)，開發(fā)了一種優(yōu)化的EAE-MAE聯(lián)合方案。

本研究旨在通過EAE和MAE聯(lián)合方法，開發(fā)一種高效環(huán)保的方法，從Chaetomorpha aerea中同時提取和純化三種主要藻膽蛋白（APC、C-PC和R-PE）。通過單因素實驗系統(tǒng)優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)（酶濃度、孵育時間、微波功率和照射時間），隨后利用響應(yīng)面方法（RSM）進一步優(yōu)化提取效率。在最佳條件下獲得的粗提取物經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G-75凝膠過濾和離子交換色譜（DEAE-Sepharose和Q-Sepharose柱）純化，得到高純度的PBPs。純化產(chǎn)物經(jīng)過光譜特性、功能基團和蛋白質(zhì)完整性分析，并通過肽測序確認其分子身份。鑒于乳腺癌的全球普遍性及先前研究顯示腺癌細胞對藻類色素的敏感性，選擇MCF-7細胞系作為評估純化PBPs細胞毒性的模型。本研究不僅建立了從Chaetomorpha aerea中高效提取PBPs的優(yōu)化方案，還為這種未充分利用的藻類資源的生物技術(shù)和制藥應(yīng)用提供了全面的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。