基于銅死亡（Cuproptosis）調(diào)控因子的甲狀腺癌生物學(xué)功能與腫瘤微環(huán)境綜合分析及銅死亡相關(guān)評(píng)分系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證
《Frontiers in Genetics》：Comprehensive analyses of biological function and tumor microenvironment with cuproptosis regulators and construction of a cuproptosis-related scoring system in thyroid cancer based on bioinformatics and experimental validation
編輯推薦：
本篇研究聚焦于甲狀腺癌（THCA）中銅死亡調(diào)控因子的生物學(xué)功能與預(yù)后價(jià)值，通過生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，系統(tǒng)揭示了銅死亡相關(guān)基因（如FDX1）的表達(dá)模式、與腫瘤微環(huán)境（TME）免疫浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)，并構(gòu)建了一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)（SWSFS算法）的銅死亡相關(guān)評(píng)分（RS）模型，該模型能有效預(yù)測(cè)甲狀腺癌患者的無進(jìn)展生存期（PFS）與無病生存期（DFS）。研究不僅深化了對(duì)銅死亡在甲狀腺癌中作用機(jī)制的理解，還為臨床預(yù)后評(píng)估與潛在治療策略提供了新的生物標(biāo)志物與思路。
引言
甲狀腺癌（Thyroid Cancer, THCA）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升。盡管多數(shù)甲狀腺癌（尤其是乳頭狀甲狀腺癌PTC）預(yù)后較好，但部分患者仍面臨復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（Regulated Cell Death, RCD）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。銅死亡（Cuproptosis）作為一種新近發(fā)現(xiàn)的、由銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式，其機(jī)制不同于凋亡、鐵死亡等其他已知死亡方式。目前已有10個(gè)銅死亡相關(guān)調(diào)控基因被鑒定，包括7個(gè)正調(diào)控基因（如FDX1、LIAS等）和3個(gè)負(fù)調(diào)控基因（如CDKN2A、GLS等）。然而，銅死亡調(diào)控因子在甲狀腺癌中的生物學(xué)功能與預(yù)后價(jià)值尚不明確。
材料與方法
研究整合了來自TCGA、GTEx及GEO數(shù)據(jù)庫的甲狀腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床信息。通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）與單樣本基因集富集分析（Single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）探索銅死亡調(diào)控因子的生物學(xué)功能。利用滑動(dòng)窗口順序前向特征選擇（Sliding Windows Sequential Forward Feature Selection, SWSFS）算法構(gòu)建銅死亡相關(guān)評(píng)分（Cuproptosis-related Score, RS）模型，以預(yù)測(cè)患者的無進(jìn)展生存期（Progression-Free Survival, PFS）與無病生存期（Disease-Free Survival, DFS）。通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)與CCK-8實(shí)驗(yàn)等方法，對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)及功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
結(jié)果
- 1.
銅死亡調(diào)控因子在甲狀腺癌中的表達(dá)與預(yù)后
分析顯示，多數(shù)銅死亡正調(diào)控因子（如FDX1、DLD、LIAS等）在甲狀腺癌組織中表達(dá)顯著低于正常組織，而負(fù)調(diào)控因子CDKN2A與GLS則高表達(dá)。FDX1的表達(dá)與較好的PFS和DFS顯著相關(guān)，是一種保護(hù)性因子。生存分析進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)DX1、LIPT1等高表達(dá)與良好的生存結(jié)局相關(guān)，而CDKN2A高表達(dá)則提示預(yù)后較差。
- 2.
銅死亡調(diào)控因子的生物學(xué)功能與通路富集
WGCNA與ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)，銅死亡正調(diào)控因子與蛋白質(zhì)分泌、氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）、MYC、MTORC1、DNA修復(fù)及脂肪生成等通路呈正相關(guān)，而與干擾素反應(yīng)、炎癥通路等免疫相關(guān)通路呈負(fù)相關(guān)。KEGG富集分析提示，銅死亡調(diào)控因子可能通過Rap1、PI3K-AKT、Hippo及MAPK等信號(hào)通路參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。
- 3.
銅死亡相關(guān)評(píng)分（RS）模型的構(gòu)建與驗(yàn)證
以FDX1為核心，結(jié)合銅死亡誘導(dǎo)劑Elesclomol的預(yù)測(cè)半數(shù)抑制濃度（IC50），篩選出637個(gè)銅死亡相關(guān)基因。通過隨機(jī)生存森林模型（Ranger）與SWSFS算法，最終選定6個(gè)基因（FDX1、RBPMS2、NMB、MAP1LC3A、GINM1、FAM229B）構(gòu)建RS模型，其計(jì)算公式為：RS = -0.78044 × FDX1 - 0.36267 × RBPMS2 - 0.12573 × NMB + 0.08012 × MAP1LC3A + 0.35546 × GINM1 + 0.03373 × FAM229B。該模型能有效區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)患者，高風(fēng)險(xiǎn)組PFS與DFS顯著較差。時(shí)間依賴性ROC曲線顯示，RS模型對(duì)1年、2年及3年P(guān)FS與DFS的預(yù)測(cè)AUC值均高于0.6。分層分析表明，無論患者處于早期或晚期階段、BRAF基因是否突變，RS模型均能提供有效的預(yù)后分層。此外，研究還構(gòu)建了列線圖（Nomogram）以直觀預(yù)測(cè)患者1年及3年生存概率，校準(zhǔn)曲線顯示預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際觀察值高度一致。
- 4.
銅死亡RS模型與腫瘤微環(huán)境免疫浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)
相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高RS評(píng)分與PI3K/AKT、氧化磷酸化等通路負(fù)相關(guān)，而與炎癥、Hedgehog、KRAS信號(hào)通路正相關(guān)。免疫浸潤(rùn)分析顯示，RS評(píng)分與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)，其中效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）與Th2細(xì)胞在高RS組中浸潤(rùn)更高，而Th17細(xì)胞則呈負(fù)相關(guān)。TIMER分析進(jìn)一步揭示，F(xiàn)DX1表達(dá)與CD8+T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)，提示銅死亡可能通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境影響甲狀腺癌的進(jìn)展。
- 5.
關(guān)鍵基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與功能探索
通過qRT-PCR驗(yàn)證，MAP1LC3A與RBPMS2在正常甲狀腺細(xì)胞中高表達(dá)，而GINM1在甲狀腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。免疫組化（IHC）結(jié)果也支持這一發(fā)現(xiàn)。在甲狀腺細(xì)胞中敲低FDX1后，MAP1LC3A、RBPMS2及GINM1的表達(dá)均下調(diào)，而銅死亡負(fù)調(diào)控因子GLS表達(dá)上調(diào)，提示這些基因可能受FDX1調(diào)控。然而，細(xì)胞克隆形成與CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)DX1敲低并未顯著影響甲狀腺細(xì)胞的增殖能力，說明FDX1在甲狀腺癌中的作用可能主要通過調(diào)控銅死亡相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)而非直接促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)來實(shí)現(xiàn)。
討論
本研究首次系統(tǒng)分析了銅死亡調(diào)控因子在甲狀腺癌中的表達(dá)模式、預(yù)后價(jià)值及生物學(xué)功能。FDX1作為核心調(diào)控因子，其低表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、不良預(yù)后及特定免疫微環(huán)境特征相關(guān)。通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)與機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建的銅死亡RS模型，為甲狀腺癌的預(yù)后預(yù)測(cè)提供了新的工具。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證進(jìn)一步揭示了FDX1與銅死亡相關(guān)基因（如MAP1LC3A、RBPMS2、GINM1）之間的調(diào)控關(guān)系，盡管FDX1本身可能不直接驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖，但其在銅死亡通路中的樞紐作用值得深入探究。研究也指出，未來需通過獨(dú)立臨床隊(duì)列驗(yàn)證模型的普適性，并進(jìn)一步闡明銅死亡與腫瘤微環(huán)境互作的分子機(jī)制。
結(jié)論
綜上所述，本研究證實(shí)了FDX1作為甲狀腺癌中關(guān)鍵的銅死亡調(diào)控因子，通過生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證構(gòu)建了一個(gè)基于銅死亡相關(guān)基因的預(yù)后評(píng)分模型。該模型能有效預(yù)測(cè)甲狀腺癌患者的PFS與DFS，并與腫瘤微環(huán)境免疫特征密切相關(guān)。研究成果不僅深化了對(duì)銅死亡在甲狀腺癌中作用機(jī)制的理解，也為開發(fā)新的預(yù)后標(biāo)志物與治療策略提供了理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。未來研究需進(jìn)一步探索銅死亡調(diào)控因子在甲狀腺癌中的具體功能機(jī)制及其臨床轉(zhuǎn)化潛力。
