本研究旨在探討視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（NMOSD）患者糞便微生物群的特定微生物特征和代謝組學(xué)譜，并通過一項縱向隊列研究評估免疫抑制劑對其腸道菌群的影響。我們招募了21名未經(jīng)治療的NMOSD患者和21名匹配的健康對照者（HC）。采用16S rRNA基因測序和超高效液相色譜-質(zhì)譜法比較組間糞便微生物組成和代謝組學(xué)譜。隨后，在NMOSD患者接受免疫抑制治療后再次收集并重新評估其糞便樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMOSD患者的腸道微生物組成和代謝組學(xué)譜與HCs明顯不同。NMOSD患者的α-多樣性指標(biāo)顯著高于HCs（P <0.001）。在屬水平上，NMOSD患者的微生物群改變特征表現(xiàn)為鏈球菌（Streptococcus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）的豐度增加，以及普拉梭菌（Faecalibacterium）、雷爾氏菌（Ralstonia）和假單胞菌（Pseudomonas）的豐度降低（所有指標(biāo)的線性判別分析得分均> 4，P < 0.001）。此外，通過未觀察狀態(tài)重建的群落系統(tǒng)發(fā)育調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，與HCs相比，NMOSD患者存在19種豐度差異的代謝物和44條改變的代謝通路。超過六個月的免疫抑制治療可能會減少這些差異，使NMOSD患者的腸道菌群組成和代謝物譜更接近HCs。

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（NMOSD）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，以橫貫性脊髓炎和視神經(jīng)炎的反復(fù)發(fā)作為特征。盡管其病因尚不清楚，但水通道蛋白-4（AQP4）已被確定為一種疾病特異性的血清自身抗體標(biāo)志物。越來越多的證據(jù)表明，環(huán)境因素在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機制和進展中起著重要作用。腸道微生物群，通常被稱為“第二大腦”，在生理和病理條件下可能通過腸道-微生物-腦軸影響大腦活動。腸道微生物組通過影響免疫系統(tǒng)和代謝通路，對這些疾病的發(fā)生有重要貢獻。胃腸道微生物群的失調(diào)會影響促炎性T細胞的分化，并可能增強器官特異性的自身免疫。腸道微生物群與AQP4蛋白之間存在廣泛的同源性，這揭示了NMOSD發(fā)病機制中的分子擬態(tài)。既往研究多基于橫斷面層面考察組間差異，可能無法完全解釋治療相關(guān)效應(yīng)。為彌補這一局限，我們進行了一項病例對照研究，比較未經(jīng)治療的NMOSD患者與HCs的腸道微生物組和代謝組學(xué)譜。此外，我們還進行了縱向取樣（在免疫抑制劑治療前和治療后六個月），以評估這些藥物如何改變NMOSD患者的腸道菌群。

本研究于2021年1月至2023年6月期間從四川大學(xué)華西醫(yī)院連續(xù)招募了共42名受試者，包括21名未經(jīng)治療的NMOSD患者（NT組）和21名HCs。患者被定義為“未經(jīng)治療”需滿足以下兩個標(biāo)準(zhǔn)之一：1）在初次診斷時未接受過免疫治療；或2）連續(xù)使用免疫調(diào)節(jié)療法少于六個月后停藥，并保持至少六個月的無治療洗脫期。所有患者均符合2015年國際NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過基于細胞的檢測確認為AQP4-IgG血清陽性。重要的是，所有患者在入組時均未接受任何免疫治療。HCs在年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、飲食習(xí)慣和地理位置方面與患者匹配。研究排除了有急性感染、胃腸道疾病、惡性腫瘤、其他自身免疫性疾病，或在入組前一個月內(nèi)服用過益生菌、抗生素或皮質(zhì)類固醇的受試者。本研究使用的免疫抑制劑為嗎替麥考酚酯（MMF），劑量為20-30mg/kg/天。研究獲得了四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有參與者在納入研究前均提供了知情同意。

所有收集的糞便樣本立即在-80°C冷凍保存直至處理。解凍后，提取基因組DNA，并使用針對細菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)的引物進行PCR擴增。PCR擴增子使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化，并使用Illumina TruSeq DNA PCR-Free文庫制備試劑盒構(gòu)建16S rRNA基因文庫。

在Illumina MiSeq平臺上進行測序，所得數(shù)據(jù)使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME， v2.0）進行分析。原始序列在組裝前進行質(zhì)量過濾。合格的配對末端讀長使用FLASH合并，然后使用UCHIME去除嵌合體。使用VSEARCH將高質(zhì)量序列以≥ 97%的相似性閾值聚類為操作分類單元。使用觀察到的物種數(shù)和Chao1指數(shù)評估微生物α-多樣性，使用Shannon和Simpson指數(shù)評估多樣性。通過基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析和置換多元方差分析評估β-多樣性。進行線性判別分析效應(yīng)大小分析以識別差異豐富的分類群。使用PICRUSt2預(yù)測宏基因組功能含量，并進行京都基因與基因組百科全書通路分析以識別與分類組成差異相關(guān)的代謝通路。

入組時收集新鮮糞便樣本，按照制造商方案懸浮于保存緩沖液中，并于-80°C冷凍保存。均質(zhì)化后，取200 μL糞便樣本真空干燥并重懸于800 μL甲醇中。所有樣品渦旋30秒，超聲處理10分鐘，并在?20 °C孵育2小時以沉淀蛋白質(zhì)。離心后收集上清液，真空干燥，并重懸于200 μL甲醇/水中。使用超高效液相色譜-質(zhì)譜法進行代謝組學(xué)分析。通過模式識別方法分析數(shù)據(jù)集。單變量分析識別組間具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的特征，而多變量偏最小二乘判別分析評估受試者間變異性并突出關(guān)鍵區(qū)分性代謝物。對這些差異代謝物進行通路分析。

定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述。使用Mann-Whitney U檢驗或Student t檢驗比較組間變量。計算錯誤發(fā)現(xiàn)率以校正多重比較并評估篩選出的差異變量。所有分析均使用GraphPad Prism或SPSS Statistics軟件進行。P值< 0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

我們的分析包括21名未經(jīng)治療的NMOSD患者和21名匹配的HCs。從所有參與者在入組時收集了糞便樣本。在這21名NMOSD患者中，有5名在免疫抑制劑治療六個月后重新檢查了糞便樣本。參與者的詳細人口統(tǒng)計學(xué)信息和臨床特征見相應(yīng)表格。

比較了未經(jīng)治療的NMOSD患者和HCs之間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。所有α-多樣性指標(biāo)在NMOSD患者中均顯著高于HCs，表明未經(jīng)治療的NMOSD患者腸道微生物的豐富度和多樣性更高。此外，與未經(jīng)治療的患者和HCs相比，接受MMF治療的NMOSD患者顯示出α-多樣性降低。

為比較組間糞便微生物群落結(jié)構(gòu)，通過計算成對Bray-Curtis距離評估了β-多樣性。基于所得距離矩陣的主坐標(biāo)分析顯示，未經(jīng)治療的NMOSD患者和HCs之間存在不同的聚類，沿主要軸有清晰的分離。置換多元方差分析證實了組間顯著的組成差異。線性判別分析進一步確定了系統(tǒng)發(fā)育聚類模式。與HCs相比，特定菌屬（鏈球菌和瘤胃球菌）在NMOSD患者中豐度顯著更高，而普拉梭菌、假單胞菌和雷爾氏菌在HCs中更豐富。對IST組的比較分析顯示，在免疫抑制劑治療的NMOSD患者和HCs之間，屬水平的分類學(xué)生物標(biāo)志物僅存在兩個顯著差異。具體而言，腸桿菌在NMOSD IST組中富集，而克雷伯氏菌在HCs中顯示出高豐度。

腸道微生物群落的門水平分析顯示，擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門是未經(jīng)治療的NMOSD患者和HCs中的主要門，共同占腸道微生物群的90%以上。在屬水平上，擬桿菌屬、普拉梭菌屬、普雷沃氏菌屬、羅斯氏菌屬和布勞特氏菌屬是豐度最高的五個類群。

對來自NMOSD患者和HCs的21份糞便樣本的代謝組進行了表征和比較。在多元分析中VIP得分> 1.0且單變量分析中P值< 0.05的特征被確定為最重要的代謝物。共有19種涉及氨基酸、脂質(zhì)、嘌呤和維生素代謝的關(guān)鍵代謝物在NMOSD患者的糞便中發(fā)生了改變。D-脯氨酸、L-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酸、Nω-乙酰組胺、Val-Ala、L-亮氨酰-L-丙氨酸、Val-Leu、Thr-Ile、Leu-Ile、Phe-Ile、腺苷、腺嘌呤、次黃嘌呤、亞油酸、棕櫚酰乙醇酰胺、5(S)-HETE和維生素B₁的水平在NMOSD糞便樣本中升高。相比之下，DL-苯丙氨酸水平在NMOSD中降低。

為了基于糞便中的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)識別具有生物學(xué)意義的模式，通過KEGG代謝庫進行了通路譜分析。總共有44條與腸道微生物相關(guān)的KEGG通路在NMOSD組和HC組之間存在差異富集，其中10條在FDR校正后仍保持顯著。升高的L-谷氨酸和L-酪氨酸在酒精中毒、癌癥中的中心碳代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收、可卡因成癮、氨酰-tRNA生物合成和苯丙胺成癮中富集。同時，L-酪氨酸還與帕金森病和硫胺素代謝相關(guān)。升高的L-蛋氨酸與癌癥中的中心碳代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收以及氨酰-tRNA生物合成有關(guān)。升高的腺苷與酒精中毒、帕金森病、嘌呤代謝和cAMP信號通路相關(guān)。較高的次黃嘌呤和硫胺素水平分別與嘌呤代謝和硫胺素代謝相關(guān)。此外，升高的(S)-乳酸在癌癥中的中心碳代謝和cAMP信號通路中富集，而升高的腺嘌呤與嘌呤代謝相關(guān)。

經(jīng)過六個月的免疫抑制治療后，重新收集并分析了未經(jīng)治療的NMOSD患者的糞便樣本。代謝組學(xué)分析顯示，與HCs相比，接受免疫抑制劑的NMOSD患者的糞便中僅有兩種關(guān)鍵代謝物發(fā)生改變。D-脯氨酸和油酸乙酯的水平在IST組中升高。總共有19條與腸道微生物相關(guān)的KEGG通路在IST組和HC組之間存在差異富集，包括酪氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙酮酸代謝、丁酸酯代謝、原核生物中的碳固定、硫代謝、cAMP信號通路、GABA能突觸、胰高血糖素信號通路、癌癥中的中心碳代謝、丙酸酯代謝、煙酸/煙酰胺代謝、雙組分系統(tǒng)、乙醛酸/二羧酸代謝、苯丙氨酸代謝、精氨酸/脯氨酸代謝和氯環(huán)己烷/氯苯降解。D-脯氨酸在精氨酸/脯氨酸代謝中富集，其余通路與升高的琥珀酸水平相關(guān)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與HCs相比，未經(jīng)治療的NMOSD患者存在顯著的腸道菌群失衡以及失調(diào)的菌群相關(guān)代謝通路。群落分析和β-多樣性揭示了兩組之間微生物組成的顯著差異。NMOSD患者糞便微生物的α-多樣性顯著高于HCs，這表明腸道菌群與NMOSD發(fā)病機制之間存在潛在聯(lián)系。我們的發(fā)現(xiàn)與之前的中國隊列研究結(jié)果一致。盡管更高的微生物多樣性通常有益，但在抑郁癥和自閉癥等疾病中也觀察到了多樣性和豐富度的升高。在我們的研究中，機會性病原體的過度生長（如鏈球菌和瘤胃球菌）是NMOSD患者腸道菌群失調(diào)的特征。先前在中國NMOSD隊列中的研究也報告了與鏈球菌的關(guān)聯(lián)。值得注意的是，鏈球菌豐度與疾病嚴重程度呈正相關(guān)。鏈球菌的免疫調(diào)節(jié)機制尚不清楚，但其過度存在與NMOSD患者短鏈脂肪酸水平降低相關(guān)，這可能增強CD4⁺T細胞活性和促炎反應(yīng)。此外，鏈球菌豐度的增加可能通過升高促炎細胞因子來促進炎癥。我們觀察到瘤胃球菌豐度在NMOSD患者的腸道菌群中增加，盡管其機制作用有待進一步研究。瘤胃球菌是一種具有環(huán)境依賴性致病作用的厭氧菌屬。該菌屬在克羅恩病、炎癥性腸病、脊柱關(guān)節(jié)炎和哮喘等多種疾病中富集。我們的數(shù)據(jù)還顯示，NMOSD患者中有益共生微生物的消耗。作為健康人腸道中的優(yōu)勢細菌屬，普拉梭菌通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸和白介素-10來抑制炎癥。它還增強腸道屏障完整性，抑制病原體入侵。假單胞菌和雷爾氏菌在NMOSD中的作用尚不清楚，有待研究。這些發(fā)現(xiàn)表明，以共生細菌減少和機會性病原體增加為特征的腸道菌群失調(diào)，可能通過炎癥介質(zhì)的失調(diào)導(dǎo)致NMOSD發(fā)病。然而，需要進一步研究來確定這種失調(diào)是引發(fā)NMOSD還是繼發(fā)于該疾病。

迄今為止，人們對腸道微生物組代謝通路與NMOSD發(fā)病機制之間的潛在聯(lián)系知之甚少。功能分析表明，腸道菌群的改變可能通過相關(guān)的代謝通路促進NMOSD的發(fā)展。在本研究中，糞便樣本的代謝組學(xué)譜分析在未經(jīng)治療的NMOSD患者中鑒定出19種顯著改變的代謝物。此外，PICRUSt分析揭示了10條與NMOSD相關(guān)的失調(diào)微生物組相關(guān)代謝通路。值得注意的是，在NMOSD患者的糞便中觀察到生糖氨基酸和生糖/生酮氨基酸的水平升高。這些發(fā)現(xiàn)表明葡萄糖和能量代謝可能存在破壞。谷氨酸代謝先前已被報道可調(diào)節(jié)靜息和活化T細胞的功能。脯氨酸是結(jié)腸上皮細胞粘液糖蛋白的關(guān)鍵成分，其在糞便樣本中的水平升高可能表明粘蛋白合成和腸道屏障功能的改變。我們假設(shè)受損的氨基酸吸收可能導(dǎo)致其在腸腔中積累。最重要的是，顯著富集的氨酰-tRNA生物合成通路表明NMOSD患者的氨基酸周轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)生物合成失調(diào)。我們的分析揭示了NMOSD患者糞便樣本中維生素B代謝的異常。我們假設(shè)NMOSD患者糞便中硫胺素水平的升高可能通過改變腸道維生素B代謝來維持微生物的生存。然而，維生素B的免疫調(diào)節(jié)作用仍知之甚少。與嘌呤代謝相關(guān)的代謝物在NMOSD患者中失調(diào)，包括次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷。腺苷是調(diào)節(jié)性T細胞分泌的關(guān)鍵免疫抑制介質(zhì)。此外，調(diào)節(jié)關(guān)鍵細胞過程的脂質(zhì)代謝在NMOSD患者中顯著改變。該通路中關(guān)鍵擾動的代謝物包括亞油酸、棕櫚酰乙醇酰胺和5(S)-HETE。這些發(fā)現(xiàn)表明脂質(zhì)碳鏈代謝與NMOSD病理學(xué)之間存在潛在聯(lián)系。因此，我們的研究為腸道菌群衍生的代謝變化如何促進NMOSD發(fā)病機制提供了機制性見解。值得注意的是，代謝可能受到藥物攝入的影響。在本研究中，未經(jīng)治療的NMOSD患者的腸道微生物組組成在免疫抑制治療后與HCs非常相似，主成分分析還顯示NMOSD患者和HCs之間的整體代謝譜存在顯著差異。治療后，這些患者的腸道微生物代謝物變得與HCs幾乎相同。這表明代謝改變不僅可能源于疾病本身，也可能源于治療干預(yù)。本研究的一個局限性是未經(jīng)治療的NMOSD患者隊列規(guī)模較小，這限制了精確評估藥物誘導(dǎo)的糞便代謝物變化的統(tǒng)計能力。未來的研究應(yīng)納入更大的未經(jīng)治療隊列，以更好地區(qū)分治療特異性的代謝轉(zhuǎn)變。

總之，我們的研究揭示了NMOSD患者存在腸道菌群失調(diào)和異常的代謝通路。免疫治療可能會使NMOSD患者的腸道菌群向HCs的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明微生物組失調(diào)促進NMOSD發(fā)病的潛在機制，也為該疾病的潛在個體化治療提供了見解。需要樣本量更大、隨訪時間更長的進一步研究來證實我們的發(fā)現(xiàn)。