骨髓炎（Osteomyelitis）是由細菌或真菌等病原體引起的骨組織及周圍組織的感染性炎癥性疾病，是骨科領域持續的臨床挑戰。盡管抗感染治療和手術技術不斷進步，但其長期復發率仍高達20%，這主要歸因于病原體耐藥、生物膜形成以及嚴重的骨組織損傷等因素。免疫系統在骨髓炎的演變中扮演著雙重角色：一方面作為防御感染的衛士，另一方面也可能成為骨組織損傷的潛在推手。先天免疫通過模式識別受體（PRRs）識別病原體相關分子模式（PAMPs），啟動炎癥反應，招募中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞。其中，中性粒細胞在吞噬病原體的同時，其過度活化也可能對骨組織造成附帶損傷。巨噬細胞則存在促炎的M1表型和抗炎的M2表型，其極化狀態影響著炎癥與修復的平衡。適應性免疫，特別是Th1和Th17細胞亞群，通過分泌干擾素-γ（IFN-γ）和白細胞介素-17（IL-17）等細胞因子，在清除病原體中也起著關鍵作用，但過量的IL-17可能過度激活破骨細胞，導致骨破壞。傳統的免疫學研究方法，如免疫組織化學、流式細胞術和酶聯免疫吸附測定（ELISA），在解析免疫細胞表型、功能和相互作用網絡方面存在局限。新興的RNA測序（RNA-seq）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術為高分辨率地描繪基因組和單細胞表達譜、揭示細胞異質性和動態變化提供了強大工具。本研究旨在整合群體與單細胞轉錄組學分析，系統描繪骨髓炎的動態基因表達景觀和免疫細胞圖譜，解析巨噬細胞在疾病進程中的核心調控作用，并識別潛在的治療靶點。

本研究首先對來自基因表達綜合數據庫（GEO）的小鼠骨髓炎時間序列數據集GSE168896進行了分析。利用FastQC和TrimGalore進行原始測序數據的質量評估與修剪，隨后使用kallisto將高質量讀數比對至小鼠參考基因組并進行定量。差異表達基因（DEGs）通過DESeq2鑒定，并采用模糊c均值聚類（Mfuzz R包）對動態基因進行聚類分析，以識別與疾病進展相關的基因集。免疫細胞浸潤分析則通過在線工具ImmuCellAI-mouse完成。在實驗層面，成功構建了小鼠骨髓炎模型，并通過蘇木精-伊紅（H&E）染色和微型計算機斷層掃描（micro-CT）證實了模型的有效性。利用10X Genomics Chromium平臺對小鼠股骨骨髓細胞進行單細胞RNA測序，數據已提交至GEO（編號GSE311208）。原始數據使用CellRanger處理，并經過嚴格的質量控制，包括線粒體基因百分比低于20%、每個細胞檢測到的基因數在500-5000之間，并使用Scrublet去除雙細胞。數據標準化和降維分析在Seurat（V5.2.0）環境中完成，細胞聚類通過均勻流形近似與投影（UMAP）可視化，并參考CellMarker 2.0數據庫對細胞簇進行手動注釋。為了深入探索關鍵細胞亞群的功能狀態，研究進一步對單核/巨噬細胞進行了亞聚類分析，并使用Monocle3進行了擬時序軌跡分析以描繪其分化路徑。轉錄因子調控網絡分析通過PySCENIC流程完成，該流程利用GRNBoost算法推斷轉錄因子（TFs）與靶基因的調控關系，并通過AUCell和SCENIC計算平均轉錄因子活性。細胞間通訊分析則借助CellChat（v1.6.1）R包，基于配體-受體（L-R）對的表達概率，探究了不同巨噬細胞亞型與其他免疫細胞之間的相互作用網絡。

對數據集GSE168896的分析顯示，第1天和第3天的樣本聚集在一起，而第7天和第14天的樣本形成獨立分支，表明存在不同的骨髓炎階段，分別被歸類為急性期和亞急性期。通過對2,382個差異表達基因進行軟聚類分析，研究確定了六個具有不同時間表達模式和功能的基因簇。例如，基因簇4（C4）從第7天開始表達增加，與白細胞活化和骨化過程相關；基因簇6（C6）包含Il17a、Il23r、核因子κB受體活化因子配體（RANKL，由Tnfsf11編碼）等基因，其表達呈進行性增加，表明其在骨發育和Wnt信號通路中發揮作用。免疫浸潤分析進一步揭示，在第3天，巨噬細胞、樹突狀細胞（DCs）和自然殺傷（NK）細胞顯著增加，而B細胞比例則逐漸下降。

通過單細胞測序分析，研究在小鼠骨髓樣本中識別出12個主要的細胞亞群，包括巨噬細胞、中性粒細胞、B細胞、細胞毒性T細胞、M2樣巨噬細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）等。其中，巨噬細胞的浸潤比例在骨髓炎發生后增加最為顯著，并且在所有免疫細胞中占比最高，這與群體轉錄組分析結果一致。

對單核/巨噬細胞的深入分析鑒定出九個轉錄組學上不同的亞群。M2樣巨噬細胞被進一步細分為兩個亞群：高表達精氨酸酶1（Arg1）和多配體蛋白聚糖4（Sdc4）的Arg1⁺Sdc4⁺巨噬細胞，以及高表達骨橋蛋白（Ibsp）和雙糖鏈蛋白聚糖（Bgn）的Ibsp⁺Bgn⁺巨噬細胞。研究發現，在骨髓炎發生后，Mif⁺Cd63⁺、Cxcl1⁺Ccl4⁺和Arg1⁺Sdc4⁺巨噬細胞的浸潤顯著增加，這一結果也得到了流式細胞術的驗證。擬時序軌跡分析表明，Tmsb10⁺S100a4⁺單核細胞處于發育起點，而Arg1⁺Sdc4⁺和Mif⁺Cd63⁺巨噬細胞亞型則是充分分化的終點。

基于SCENIC的調控子分析揭示了各細胞類型特異性的核心轉錄調控網絡。在Arg1⁺Sdc4⁺巨噬細胞中，ETS變異轉錄因子4（Etv4）和RAR相關孤兒受體A（Rora）被鑒定為最特異的調控因子；而在Cxcl1⁺Ccl4⁺巨噬細胞中，則是Etv4和V-Myb禽成髓細胞瘤病毒癌基因同源物（Myb）。

細胞通訊（CellChat）分析顯示，Arg1⁺Sdc4⁺、Cxcl1⁺Ccl4⁺和Mif⁺Cd63⁺巨噬細胞亞型與其他免疫細胞之間具有最活躍的“外向”交互作用。CCL和CXCL信號通路是介導細胞間通訊最活躍的途徑。其中，Cxcl2–Cxcr2和Ccl3–Ccr1這兩對配體-受體在上述巨噬細胞亞型的通訊中貢獻最大。在數據集GSE168896中，Ccl3和Cxcl2出現在基因簇4中，并且其表達隨時間延長而增加，進一步提示Ccl3–Ccr1和Cxcl2–Cxcr2信號軸可能通過巨噬細胞在骨髓炎中發揮關鍵作用。

本研究發現，在骨髓炎進程中，Arg1⁺Sdc4⁺和Cxcl1⁺Ccl4⁺巨噬細胞在感染后出現，而Mif⁺Cd63⁺巨噬細胞則顯著增加。

綜上，本研究通過整合多組學分析，系統描繪了骨髓炎進程中復雜的免疫景觀動態變化，并首次精確定位了三個關鍵的巨噬細胞功能亞群及其依賴的核心信號通路。這些發現不僅深化了對骨髓炎免疫病理機制的理解，也為開發針對特定巨噬細胞亞群或趨化因子信號通路的靶向治療策略提供了新的理論依據和潛在干預靶點。未來的研究需要在臨床環境中進一步驗證這些發現，并探索能夠改善骨髓炎患者預后的新型治療策略。