《Frontiers in Microbiology》：Safety and probiotic characterization of Lacticaseibacillus rhamnosus SAL2: insights from integrated genomics and functional validation
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這篇研究采用整合基因組-表型框架，對新分離的Lacticaseibacillus rhamnosus SAL2菌株進行了全面的益生潛能與安全性評估。通過全基因組測序與功能驗證，并與經典益生菌參照株L. rhamnosus GG進行多維比對，研究揭示了SAL2具有匹配的安全核心特征和益生特性，并在抗氧化活性方面表現更為優異。其細胞外代謝產物在清除自由基（如DPPH、羥基自由基和超氧陰離子）中發揮了主導作用，這為開發具有特定健康益處的微生態制劑或功能性食品提供了有力的候選菌株。
1 引言
隨著消費者對天然健康促進劑需求的增長，益生菌產業蓬勃發展。Lacticaseibacillus rhamnosus是一種兼性厭氧、耐酸、不產孢的革蘭氏陽性菌，因其抗氧化特性、免疫調節作用和平衡腸道菌群的能力而廣受認可。該物種已獲中國國家衛生健康委員會列為安全食品級微生物。然而，益生菌評估范式正從主要關注表型特征轉向更深入地理解基因組基礎和機制作用。盡管評估框架已建立，但將高分辨率基因組學與靶向功能測定整合應用于新分離菌株表征方面仍存在顯著空白。此外，雖然多種乳酸桿菌的抗氧化活性已被記載，但其主要機制——究竟是細胞結合成分（如表面層蛋白）還是分泌的細胞外代謝物——在不同研究中的表征仍不一致。本研究旨在全面評估獨立分離菌株Lacticaseibacillus rhamnosus SAL2的益生潛能和安全性。
2 材料與方法
本研究采用了混合測序策略（Illumina/PacBio）對L. rhamnosus SAL2進行完整的從頭組裝和注釋。通過多維體外表征，基因組學評估其安全譜，功能驗證關鍵益生屬性（包括胃腸道耐受性、粘膜粘附和抗生素敏感性），定量評估其抗氧化能力并闡明該活性的主要貢獻者（細胞 vs. 代謝物），并將所有特征直接與參照株L. rhamnosus GG進行基準比較。具體實驗包括溶血活性測定、抗生素敏感性測試（Kirby-Bauer紙片擴散法）、高鹽耐受性測定（1%-8% NaCl）、牛膽鹽耐受性測定（0.1%-0.4%）、模擬胃腸液耐受性測定、自聚集與疏水性測定，以及抗氧化活性測定（包括H2O2耐受性、DPPH自由基清除、羥基自由基清除和超氧陰離子自由基清除）。
3 結果
3.1 L. rhamnosus SAL2的全基因組測序分析與功能挖掘
L. rhamnosus SAL2的基因組由一個單環狀染色體（2,989,570 bp；GC含量46.76%）組成，不含質粒。共預測到2767個開放閱讀框（ORFs）。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示，碳水化合物代謝相關基因最多（310個）。基因本體論（GO）分析中，細胞氮化合物代謝過程（730個基因）占主導。直系同源蛋白簇（COG）分類中，碳水化合物轉運與代謝（285個基因）最為豐富。碳水化合物活性酶（CAZy）數據庫注釋到112個基因，其中糖苷水解酶（GHs）最多（49個）。轉運蛋白分類數據庫（TCDB）分析識別出615個與轉運系統相關的基因。僅在毒力因子數據庫（VFDB）中發現一個與免疫調節和抗吞噬活性相關的毒力相關基因（gndA）。PhiSpy軟件預測了基因組內8個前噬菌體區域。功能注釋還突出了一個強大的抗氧化基因庫，包括msrA/B、tpx、trxA/B和btuE等。
3.2 L. rhamnosus SAL2的安全性評估
溶血試驗顯示，金黃色葡萄球菌（陽性對照）呈現β-溶血，而L. rhamnosus SAL2和L. rhamnosus GG均未顯示溶血活性。抗生素敏感性測試表明，L. rhamnosus SAL2對四環素、紅霉素、青霉素、氨芐西林、慶大霉素、克林霉素、頭孢噻肟、左氧氟沙星和利奈唑胺敏感，對頭孢吡肟中度敏感，對萬古霉素耐藥。相比之下，L. rhamnosus GG對青霉素、氨芐西林、萬古霉素和頭孢吡肟耐藥，對頭孢噻肟中度敏感。
3.3 L. rhamnosus SAL2的益生特性表征
在高鹽脅迫下，L. rhamnosus GG在1%-4% NaCl下存活率高于SAL2。然而，在高鹽壓力（6%-8% NaCl）下，L. rhamnosus SAL2表現出顯著更優的存活率，兩種菌株的存活率均維持在90%以上。在含有0.1%-0.4%牛膽鹽的培養基中，兩種菌株的生長均受到抑制，表明其膽鹽耐受性有限。在模擬腸液中，L. rhamnosus SAL2的存活率在6小時內持續增加，而L. rhamnosus GG的存活率在4小時后下降。在模擬胃液中，兩種菌株在pH 2.0–2.5下存活率大于80%，但在pH 1.5下超過2小時則無法存活。自聚集能力方面，L. rhamnosus SAL2顯著高于L. rhamnosus GG。相反，L. rhamnosus GG的疏水性大于L. rhamnosus SAL2。
3.4 L. rhamnosus SAL2的抗氧化活性
在1–9 mM H2O2條件下，L. rhamnosus SAL2保持了超過95%的存活率，在10 mM時輕微下降至87.90%。相比之下，L. rhamnosus GG的存活率從100%（1 mM）急劇下降至48.44%（10 mM）。在≥2 mM H2O2濃度下，L. rhamnosus SAL2的耐受性顯著高于L. rhamnosus GG。在DPPH自由基清除能力上，兩種菌株在整個培養期間都顯示出穩定的清除率。無細胞發酵上清液的活性顯著高于細胞懸浮液，且L. rhamnosus SAL2細胞懸浮液的活性優于L. rhamnosus GG。這表明大部分DPPH自由基清除化合物位于無細胞發酵上清液中。在羥基自由基清除能力上，兩種菌株的無細胞發酵上清液均優于細胞懸浮液。L. rhamnosus SAL2的無細胞發酵上清液在48小時達到峰值活性。在超氧陰離子清除能力上，L. rhamnosus SAL2的無細胞發酵上清液活性隨時間推移逐步增加，而L. rhamnosus GG的無細胞發酵上清液則呈現波動趨勢。L. rhamnosus SAL2的無細胞發酵上清液在所有時間點始終優于L. rhamnosus GG，而細胞懸浮液則表現出可忽略的活性。這進一步證實了自由基清除代謝物主要分泌到細胞外環境中。
4 討論
L. rhamnosus SAL2基因組在COG和KEGG數據庫中顯示出與碳水化合物轉運和代謝相關的基因最為豐富。其豐富的碳水化合物活性酶（CAZymes）使其能夠降解多種碳水化合物并合成復雜多糖。基因組中高比例的氧化還原酶編碼基因對于自由基清除、氧化還原穩態和細胞信號傳導至關重要。其抗氧化基因簇不僅加強了細胞內防御，還可能通過影響氧化還原狀態來調節宿主免疫反應。鑒定出的毒力相關基因gndA可能增強了其生態位適應性和氧化應激恢復力。基因組中八個完整的前噬菌體區域可能調節遺傳可塑性、生物膜發育和粘附功效。溶血活性檢測不到，符合益生菌安全要求。對萬古霉素和頭孢菌素的固有耐藥性與乳桿菌的典型特征一致，且由于不含質粒，最小化了水平基因轉移風險。在高滲脅迫下，菌株通過合成相容性溶質來應對。兩種菌株在模擬胃液（pH 2.0–2.5）中表現出高存活率，但無法在pH 1.5下長期存活。在模擬腸液中，L. rhamnosus SAL2顯示出逐漸增加的存活率，表明其應激適應或修復機制可能更強。L. rhamnosus SAL2接近完全的自聚集能力預示著其具有增強的粘膜粘附和生物膜形成潛力，而L. rhamnosus GG更高的疏水性可能增強了其與上皮細胞的結合親和力。L. rhamnosus SAL2在H2O2耐受性方面的優越表現可能歸因于上調的抗氧化基因。無細胞發酵上清液優異的自由基清除活性歸因于分泌的抗氧化劑，如胞外多糖、酚類化合物和金屬螯合劑，而細胞懸浮液的活性則較為有限，突顯了關鍵抗氧化劑的細胞外定位。
總之，L. rhamnosus SAL2表現出卓越的環境適應力、安全性和益生潛力。其高鹽和氧化應激耐受性，結合更好的粘附潛力和抗氧化分泌能力，使其成為調節腸道菌群的有前景的候選菌株。該菌株的胞外多糖可能是其抗氧化功效的核心，值得進一步進行結構和功能表征，以探索其作為后生元在炎癥、免疫和代謝紊亂中的治療應用。
